男性不育及遗传因素研究进展

王志强 王剑 陕文生

·综述与讲座·

男性不育及遗传因素研究进展

王志强 王剑 陕文生

不育症是一个严重的社会问题，其中男性因素所致的不育约占到所有不育症的一半。我们计划在近期的文献的背景下探讨在人类精子发生过程中起着重要的作用的在Y染色体或者常染色体上的基因。检索以下关键词：男性不育基因，精子发生的遗传学来获得本文所需信息。结果利用基因敲除小鼠模型阐明的生精功能机制已经取得了显著的进展，但是该信息并未直接应用于人。然而，已经证实几个重要基因的突变可以引起不育。本文中将讨论Y染色体中无精子症区域(AZF)的一些确定可导致不育的基因，和常染色体上的SYKP3，KLHL10，AURKC和SPATA16基因。阐明男性不育的潜在基因，可以帮助我们更好理解不育的起因，从而帮助我们更好地为患者量身定制治疗策略。

男性不育；无精子症因素；AURKC；KLHL10；SPATA16；SYCP3

据WHO调查，15%的育龄夫妇存在不育问题，全世界约有8 000万对左右，并且每年以200万对的速度递增。许多社会和环境因素，包括社会进步导致的女性结婚年龄增大，也对导致不孕不育病人数量增多有影响[1]。大约有一半的不孕不育是由男性因素引起的，而男性不育症的各种治疗方法效果都比较稳定，包括采取激素治疗、营养疗法、抗感染等病因和支持治疗，但临床效果均不理想，尤其是对于不明原因的特发性少、弱精患者，更无特异性疗法。尽管辅助生殖技术，尤其MD-TESE(显微镜下睾丸取精术)和ICSI(单精子卵泡浆内注射)在一定程度上解决了许多严重少、弱精子症男性患者的生育问题，但目前对于睾丸内没有成熟精子的病人没有有效的办法。尽管有证据表明，许多无精子症患者有遗传易感性，但大多数情况下原因仍然未知[2]。最近的基因敲除鼠的研究表明许多基因与无精子症有关，其机制也在逐渐阐明。然而这些研究鲜有用于人体，因为小鼠的结果与人体试验并不总是对等。我们这里将讨论我们的实验结果和与无精子症明确相关的基因。

1 无精子症和Y染色体

1976年，Tiepolo和Zuffardi首次提出并解释了Y染色体在无精子症中扮演的角色。他们在显微镜下检测6例无精子症的患者并且提出无精子症致病基因多位于此区，他们将其命名为无精子症因子(AZF)区[3]。随后的研究，如Vogt等[4]的研究进一步说明了AZF区的特点，Reijo等[5]发现89例患有非梗阻性无精子症(NOA)患者中12例(13%)AZF区有缺失。这些研究也表明此区有无精子症有密切联系。Vogt等[6]进一步阐明了由于睾丸组织类型不同，微缺失主要集中在3个区域，其将AZF区分为三个亚区：AZFa，AZFb和AZFc。虽然使用MD-TESE从患有AZFa，AZFb或AZFb + AZFc缺失的患者中取出精子非常困难，但是在只有AZFc缺失的患者睾丸中取出精子成功率高达(约70%)[7,8]。

2 无精子症基因群

DAZ 无精子症缺失(DAZ)基因，1995年由Reijo等人分离出来[5]。DAZ位于AZFc区。其表达特定于睾丸，并且编码一个含有RNP/RRM区和一个RNA结合的功能区和七个串联重复的14个残基的蛋白[9,10]。Tiepolo和Zuffardi在1976年第一次提出的AZF区的概念之后19年，首次确定了DAZ是人类第一个由于基因突变导致无精子症的基因。该项研究引起了对其他无精子症候选基因的研究，但是DAZ仍旧为最有代表性的基因[11,12]。

RBMY 1997年，Elliott等[13]报告了第二例无精子症基因，RNA结合基序基因(RBMY，位于Y染色体)。RMBY也位于AZFb区，像DAZ一样转录RNA结合蛋白。RMBY特异性表达在胎儿的生殖细胞中，青少年和成年人睾丸中，但是在体细胞如Sertoli细胞中无表达。RMBY的缺失只与生殖细胞分化早期的减数分裂有关。这项研究表明RBMY在精子发生过程中起到了重要的作用。

USP9Y 1999年，Sun等[14]确定了AZFa区一个新的与精子发生相关的基因，USPY9(又称DFFRY)。应用576个NOA患者或者严重的少精子症患者(精子计数≦5百万/ml)还有96个健康个体的DNA，通过单链构象多态性和序列分析发现其中一个患者有一个4 bp 的内含子剪接供体位点7基因缺失。该缺失导致了一个框架移位和外显子7的缺乏，引起蛋白水平下降约90%。

3 常染色体

上述提到的基因是典型的位于Y染色体AZF区域的精子发生基因。这个区域已经被深入的研究分析，最近确定的AZF基因是在1999年被确定的USP9Y。然而，有关基因敲除小鼠的研究已确定了大量的常染色体精子发生基因。这表明常染色体上也存在人类精子缺乏症的相关基因。

SYCP3 Yuan等[15]在基因敲除鼠的研究中报道了SYCP3(SCP3)。联会丝复合物蛋白3(SYCP3)是一种DNA结合蛋白，与突触有关并共同参与生殖细胞减数分裂的过程[16-18]。虽然雄性和雌性SYCP3基因敲除小鼠发育都正常，但是纯合突变的雄性鼠没有生殖潜力。这类基因敲除小鼠的睾丸明显较小，组织学显示其减数分裂阻滞，即完全没有正常减数分裂后形成的圆形及细长的精细胞，更没有成熟的精子。与野生型雌鼠相比，雌性SYCP3基因敲除鼠即使能够妊娠和分娩，但其生育的后代明显少。随后的调查显示，由于染色体畸变导致胎死宫内几率升高，从而导致同窝生仔数减少，同时随着小鼠年龄的增长，死胎率也随之增加。

我们假设SYCP3在人类精子发生过程中也同样扮演着重要角色的基础上，进行了更深入的研究。我们分离出人SYCP3的cDNA，发现该基因位于12号染色体(12q23)上，且在睾丸中有特异性表达[19]。该基因编码一种236个氨基酸构成的、有两个卷曲螺旋域的蛋白质。对19个由于异常减数分裂导致的精子缺乏症患者的SYCP3所有编码区域和相邻的内含子的突变进行分析，发现其中2个患者第643核苷酸位点存在一个腺苷基团的杂合缺失点。然而来自75名健康男性的DNA测序未在这些位点发现突变，这也排除基因多态性的可能(P=0.039)。已经确定的是，在鼠SYCP3基因的3个区域出现的卷曲螺旋域在蛋白质结合中起着重要的作用[20]。在人基因组中该缺失点位于卷曲螺旋域编码区，这能导致转录框架转移和终止密码子的提前出现，最终导致一个不完整的卷曲螺旋区域形成。我们进行了该突变的功能分析，结果显示，截短了人的SYCP3失去了介导蛋白质间相互作用的功能。

这些发现代表着第一个常染色体精子缺乏相关基因的识别过程，即在Y染色体AZF区域以外的，位于人12号染色体的SYCP3。Bolor等[21]随后报道了人SYCP3基因突变与复发性流产有关，26个不明原因复发性流产的女性中有2人携带SYCP3基因独立的杂合核苷酸突变，这在150名可生育女性的检测结果中是不存在的。对隐匿这2种突变之一的微基因转录本进行分析，结果显示这两种突变均影响正常剪接，可能导致c端突变蛋白的产生。当在不同的系统中共同表达时，这种突变蛋白可在体外与其野生型相互作用，抑制SYCP3蛋白质形成正常的纤维。已有研究显示，这些突变可能会通过显性抑制的方式导致异常的联合丝复合物的形成，从而导致染色体行为异常，这可能会反过来导致复发性流产。这些数据表明，SYCP3上的突变会通过减数分裂阻滞导致男性精子缺乏和女性复发性流产。

由于发现SYCP3基因突变导致男性不育，所以现在许多研究人员在寻找其他可能导致男性不育的常染色体基因突变。

KLHL10 2006年，Yatsenko等采用了一种新的方式来识别与男性不育有关的基因[22]。他们探索了从人精液中惰性转录精细胞里获得mRNA全长的可行性，以此作为从候选生殖相关基因中鉴别生殖相关突变的非侵入性诊断方式。精子浓度范围大的不育症患者，其多种单倍体生殖细胞表达基因的逆转录聚合酶链反应的效率为91%～99%。使用这种方法,研究者们确定了7名少精子症患者生殖细胞特异性基因KLHL10(位于17q21)上的错误和剪接突变。鼠KLHL10是精子形成的关键基因，且其通过剂量敏感的方式发挥作用。杂合性的KLHL10无效突变的特点是生殖细胞损失和精子细胞形态缺陷[23]。270个严重少精症患者中有3人存在KLHL10突变，而在395人的对照组中没有这种情况。在酵母菌相互作用实验中，2个KLHL10错义突变(A313T和Q216P)导致其翻译产物与野生型蛋白质形成受损的同源二聚体，最终导致蛋白功能障碍。这些结果表明，少精症患者的KLHL10突变减少了同源二聚体的形成。

Dieterich等[24,25]对10个不育症男性进行了全基因组微卫星扫描分析，这10个患者有正常体细胞核型，但精子形态不典型，主要表现为大头精子，不同数量的尾部以及染色体内容增加。在这10个患者中，研究者们发现了一个共同的纯合性区域，该区域有极光激酶C基因(AURKC，位于19q13)，AURKC在睾丸中有显著表达[26,27]，并被推测参与胞质分裂，有丝分裂和减数分裂[28,29]。在全部10个患者中均检测到AURKC编码区存在单个核苷酸缺失(c.144delC)。基础突变(L49Wfsx22)导致翻译过早终止，产生一种缺乏激酶结构域的截短蛋白。体内和体外的功能分析显示了截短蛋白功能严重缺失。AURKC的纯合突变导致大头的多倍体精子形成，并导致男性不育。另有研究报道，AURKC显著突变导致巨型精子症[30,31]。

SPATA16 圆头精子症是一种罕见的疾病(在不育男性中发生率<0.1%)，为严重的精子畸形症，表现为一次射出的精液中全部都是圆头精子而无顶体精子，或一部分是圆头精子、同时伴有不同比例(20%～90%)的精子顶体缺乏[32,33]。精液中全都是圆头精子的男性是没有生育能力的，这些患者即使是借助ICSI，生育率仍然很低。圆头精子症源于精子形成障碍，虽然其根本原因仍未确定，但家族病例报告[34]和逆行性小鼠模型实验[35,36]支持遗传因素的病因理论。然而，还没有发现可诱发疾病的突变。Dam等[33]报道了1个家族中的3个不育症兄弟均存在精子生成特异性基因SPATA16(位于3q26)的纯合性突变。2014年，Karaca等[37]报道了第一例成功通过ICSI授孕成功的SPATA16纯合子突变的29岁不育症男性病例。

结论

男性因素不育是导致不孕不育的重要原因。目前男性不育的几个原因，包括内分泌疾病，染色体异常和Y染色体的微缺失已确定。然而，大多数的男性不育症仍然无法解释，非梗阻性无精子症更是精子缺乏症最严重的形式。据估计，超过2 500个基因在精子发生中发挥作用，并很可能这些基因突变或异常导致许多不明原因的男性不育症患者。随着现代分子生物学和遗传学的不断发展，尤其是高通量测序技术和基因捕获技术临床应用的发展，会有越来越多的与不育有关的新基因被发现，将为男性不育的遗传学诊断开辟新的道路。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.039

项目来源：甘肃省自然科学基金项目(编号：1606RJZA167);甘肃省中医药管理局科研项目(编号：GZK-2014-48)

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