高耐性酱油酵母选育及其高密度发酵调控

陈雄，李欣，王志，代俊

湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068

高耐性酱油酵母选育及其高密度发酵调控

陈雄，李欣，王志，代俊

湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，武汉 430068

陈雄，教授，湖北工业大学生物工程与食品学院副院长，湖北省有突出贡献中青年专家，湖北省食品安全标准审评委员会委员，湖北工业大学“南湖学者”特聘教授。《生物资源》、《化学与生物工程》杂志编委，曾荣获“湖北省先进工作者”、“湖北五一劳动奖章”、“湖北师德标兵”、“湖北青年五四奖章”等荣誉。主要研究领域为酵母工程、酿造工程和食品生物技术。主持纵横向科研项目40余项，发表三大检索收录论文30余篇，荣获国家、省级科技成果奖励6项，其中国家科技进步二等奖1项，湖北省科技进步一等奖1项。E-mail：cx163_qx@163.com，chenxiong@ mail.hbut.edu.cn

高耐性酵母广泛应用于食品、酿造、饲料、生物能源等行业，酵母的耐受性对其生产和应用有着决定性影响。高耐性酵母菌种改良是酵母资源利用的关键步骤，高密度发酵是克服耐性酵母产业化的主要瓶颈技术。对传统酿造食品酱油生产中常用的耐高盐酵母菌株的选育、耐性机制及其高密度发酵技术研究进展进行了综述。

高耐性酱油酵母；选育；抗逆机制；高密度发酵

酵母是目前唯一年产量超过百万吨的微生物制品，其应用范围覆盖了食品和化学工业、健康产业、基础生物学、生物医药工程和环境工程等多个领域[1]。我国是世界上酱油产销量最多的国家，2015年产量约1000万吨，约占世界总产量的65%。在传统酿造酱油发酵过程中，存在7个属23个种的耐盐酵母菌[2]，其中与酱油质量关系最密切的是鲁氏酵母、易变球拟酵母、埃契氏球拟酵母和酱醪接合酵母等。在酱油高盐稀态酱醪发酵过程中，主要使用的耐盐产香酵母是T酵母（Torulopsis versatilis）、S酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和C酵母（Candida versatilis）[3]。鲁氏酵母是生产酱油、日本味（miso）和泰国发酵鱼制品（plaa-som）等发酵制品的重要菌株[4-5]。作为酱油发酵过程中的主发酵酵母，鲁氏酵母参与酱油酿造中后期风味物质形成，可产生乙醇、异戊醇等小分子醇类和甘油、阿拉伯糖醇等糖醇类，以及4-基呋喃酮类等风味成分[6]。球拟酵母是后熟酵母，通过合成4-乙基愈创木酚、4-乙基愈苯酚等酚类物质，赋予酱油主体香味[7]。

1 高耐性酱油酵母选育

鲁氏酵母具有典型的酵母菌落形态特征，是最常见的嗜高渗透压酵母菌。在18%NaCl条件下生长正常，在24%NaCl浓度时仍具有生长能力；能在Aw0.62的果糖溶液以及Aw0.65的葡萄糖/甘油溶液中生长[8]。球拟酵母，多边芽殖，菌体呈球形、卵形或略长形。在液体培养基中培养时有沉渣及环产生，有时生成菌璞，不形成孢子[9]。

受限于食品工业中对微生物菌种安全的要求，高耐性酵母菌的育种技术主要是基于传统的方法和原理，如直接筛选、诱变育种和原生质体融合等。耐性酿造酵母天然存在于腌制品（如酱菜、酱类等）、酱油、蜜饯和一些高糖分的水果中，因此基于高效的筛选策略从这些原料中获取优良菌株是最直接的途径，而且，能保证菌株的安全性。施安辉[10]在酱菜中分离出一株耐盐产酯酵母（编号为产酯酵母8号），产乙酸乙酯能力为119.14mg/ dL，在12%～14%NaCl培养基中生长良好。陈雄等[11]利用高通量筛选技术从我国不同地区的不同民间酿造食品中获得能在24%盐浓度下生长，且具有0～60%葡萄糖耐受能力的风味鲁氏酵母菌株CCTCC M 2013310，可产生苯乙醇、正丁醇等风味物质。

诱变育种是将这些高产菌种经过一些物理（紫外线、等离子、γ射线等）或者化学诱变（氯化锂、亚硝基胍等）处理后再逆境筛选。实际使用的菌株大多采用此方法选育。王弋博等[12]从天水市秦安县和甘谷县盐碱地分离出的YB-9菌株经紫外线与亚硝酸复合诱变后，得到具有240g/L耐盐度的YB-9-N1菌株，比出发菌株的耐盐度提高了84.6%。通过对产酯酵母（Saccharomyces sp.）用紫外线、硫酸二乙酯复合诱变处理和TTC培养基筛选，于同立等[13]共筛选出代谢活力强的菌株385个，通过耐盐性、嗜热性实验，筛选出4株可在7%～13%NaCl和42℃培养条件下，正常生长、繁殖代谢能力强的优良菌株。司晓光等[14]以产丙酮酸的光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）Tp19为出发菌株，采用常压室温等离子诱变系统（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）进行诱变，根据CaCO3筛选平板透明圈与菌落直径比以及100孔板产酸量快速筛选丙酮酸高产突变株。最后通过摇瓶发酵复筛，选育出一株遗传稳定的突变株A214，丙酮酸产量达到37.43g/L，比出发菌株提高了13.69%。因此，以ARTP技术为代表的新一代高通量诱变筛选技术能快捷安全高效地获得目标菌株，在高耐性酵母细胞育种中的应用有望逐渐展开。

原生质体融合/杂交技术于20世纪60年代建立，通过将遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合/杂交以获得兼有双亲优良遗传性状的稳定重组子，现已成为一种常用的微生物育种技术，也是工业酵母选育的有效途径之一。韩德权等[15]对一株耐盐性鲁氏接合酵母的原生质体化及再生条件进行了实验研究，发现较好的原生质体化条件为：在1.5mol/L山梨糖醇、细胞壁溶解酶Zymolyase20T浓度为0.5mg/mL（10unit/mL）、0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.0）中，30℃处理60min，鲁氏酵母原生质体化率可达99%以上, 再生率达30%以上。基于紫外线及甲基磺酸乙酯诱变和原生质体融合技术，通过NaCl梯度逆境筛选，获得了具有更高耐盐性的酿酒酵母S3-4菌株，其耐盐性由100g/L提高到180g/L，可以有效提高乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯、乙酸等物质的含量[16]。Kim等[17]通过鲁氏接合酵母和易变球拟酵母杂交获得一株能在酱油中产生一些特征性香味化合物的新的杂交种。部分酱油酵母菌种如表1所示。

表1 酱油酵母的选育

2 酱油酵母抗逆机制

作为一种典型的耐性酵母，酱油酵母在细胞和代谢水平上的耐盐机制被广泛研究。Watanabe等[18]总结了鲁氏酵母耐盐机制主要有：一是合成胞内渗透压调节物；二是通过Na+/H+-反向转运蛋白和Na+-ATP酶，维持胞内阳离子的动态平衡。盐胁迫下，以甘油为主的多元醇和海藻糖被诱导合成作为鲁氏酵母抗渗物；细胞形态维持结构也发生变化，细胞膜麦角固醇的含量和种类发生改变，细胞壁变得更薄，细胞壁几丁质含量下降，脂类组成也发生变化以降低甘油的渗漏[19-22]。同时，盐对鲁氏酵母的胁迫除表现为胞内积累钠离子胁迫和渗透压胁迫外，还会产生次级的氧化胁迫，即产生活性氧（ROS）造成氧化损伤[23]。

很多学者对鲁氏酵母耐盐机理从分子水平进行了研究[24-27]。鲁氏酵母耐盐性是个多基因现象，相关基因主要有ZrSOD2、ZrSOD22、SAT1、HOG1、ZrATP2、ZrPMA1、ZrNHA1和ENA1/PMR2A等。其中，由ZrSOD2编码的Na+/H+-反向转运蛋白对鲁氏酵母耐盐性起到非常重要的作用。Iwaki等[24]对ZrSOD2克隆和基因缺失的研究表明，该转运蛋白依赖质膜上ATP酶产生的跨膜H+梯度，将细胞质内的Na+外排，实现鲁氏酵母在高盐环境中的生长。有趣的是，耐盐鲁氏酵母只有一种类型的序列高度相似、不同等位基因的反向转运蛋白基因，如Zr-SOD2、ZrSOD22和ZrSOD2-22，其中，ZrSOD2-22存在于鲁氏酵母CBS732T，而ZrSOD2和ZrSOD22存在于鲁氏酵母ATCC42981，这两者都能增强酿酒酵母盐敏感菌株的耐盐性，但是只有ZrSOD2能在鲁氏酵母中转录。

相比鲁氏酵母，球拟酵母的耐性机制研究较少。Chen等[28]针对莫格球拟酵母从细胞、代谢和酶水平研究了高盐耐受机理。结果表明酵母细胞发生了多方面的变化以适应高盐环镜，如细胞壁增厚、细胞膜饱和度增加、空泡化程度降低、胞内生物相容性物浓度上升及PM-ATPase活力提升等。这些变化有利于维持细胞结构的完整性，降低钠离子对胞内代谢的毒性。徐沙等基于表达谱芯片技术和二维蛋白电泳等组学技术，研究了光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata）在不同盐浓度下的差异。结果表明高渗会诱导多类基因的表达和蛋白水平提升，特别是细胞壁和细胞膜合成相关基因、中心代谢途径蛋白和相容性溶质氨基酸合成途径蛋白[29-30]。可见，球拟酵母对盐逆境的响应是多方面和多层次的过程。

3 酱油酵母高密度发酵调控技术

现代发酵工业中，细胞密度是影响目标产物最终产量的关键因素。高密度的细胞数能为发酵生产代谢物提供大量的合成者。随着分子生物学和遗传工程的崛起，高密度发酵调控技术研究领域从传统的菌种筛选、培养基筛选与优化、发酵过程控制、补料策略研究向遗传特性改造、外源蛋白改造等方面扩展。对于食品工业中的酵母，为保证安全性，通过分子手段改造以达到细胞高密度生长的方法受到严格限制，因此，发酵调控技术依然是现在的主要手段。高密度发酵调控技术的关键是细胞代谢流的再分配，即通过过程调控和补料策略强化细胞繁殖相关代谢的通量（图1）。

图1 微生物细胞高密度发酵调控

酵母高密度发酵技术最初是为了解决酿酒酵母活细胞数低的问题，现已取得巨大成功。目前，工厂规模的酿酒酵母湿重一般为180～200g/L。酱油活性干酵母能有效提升酱油生产效率[31-32]。相比酿酒酵母和毕赤酵母，酱油酵母的高密度发酵技术长期得不到足够的关注，其活性干酵母的高效生产与制备受到极大的限制，严重影响了其在酱油酿造中的生产应用。笔者团队针对高耐性酱油酵母发酵强度低的问题，研究了鲁氏酵母发酵培养基，优化了10L发酵罐发酵参数，并整合营养条件-过程控制-指数流加策略，有效控制了代谢副产物的生成并提升了营养物向生物量转化效率，最终建立了高耐受性酵母高密度发酵过程[33-35]。在摇瓶阶段，鲁氏酵母活菌数超过100亿，比已报道的文献[36]提高近10倍；10L机械搅拌通风发酵罐，最大生物量超过70g/L（干重）[35]。更重要的是，该酵母的耐盐能力在高密度繁殖后没有降低，为大规模生产应用奠定了良好的基础。

4 展 望

随着人们生活质量的提高，传统酿造食品正处于技术升级的新阶段。优良的耐逆境酵母菌株能有效提升酱油生产效率和产品品质及风味，高耐性酵母的高密度发酵技术是体现经济效益和工作效率的关键。因此，基于新技术诱变筛选高品质酱油酵母及其高密度细胞发酵技术将为酿造食品的升级换代提供坚实的基础。

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Breeding and high density fermentation control research of high tolerance soy sauce yeast

CHEN Xiong，LI Xin，WANG Zhi，DAI Jun

Key Laboratory of Fermentation Engineering (Education Ministry), Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Bioengineering and Food Science College, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China

High tolerance yeast is widely used in many industries, especially in food, brewing, feed, and bio-energy f eld. The tolerance capability of yeast has a decisive inf uence on its production and application. The improvement of yeast strains is the key step in the utilization of yeast resources, and high density fermentation technology is the main bottle-neck for the yeast industrialization. In this paper, the breeding, tolerance mechanism, and high density fermentation of the halophilic yeast strains used in the traditional brewing food soy sauce are reviewed.

soy sauce yeast; breeding; resistant mechanism; high density fermentation

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.011

湖北省自然科学基金重点项目（2012FFA058）