炎症性肠病与干细胞源性微囊泡的研究进展*

刘与进， 范 恒， 刘星星

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022

综 述

炎症性肠病与干细胞源性微囊泡的研究进展*

刘与进， 范 恒△， 刘星星

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科，武汉 430022

炎症性肠病； 溃疡性结肠炎； 克罗恩病； 干细胞； 微囊泡； 外泌体

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因与发病机制复杂且尚不完全清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative disease，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。目前研究认为，IBD与肠道免疫紊乱及肠道上皮细胞凋亡导致的肠道黏膜屏障破坏有着密切关系。干细胞源微囊泡是源于干细胞的膜性小体，具有免疫调节以及抑制凋亡、促进组织损伤修复等作用。本文就干细胞源微囊泡对IBD的免疫调节及抑制肠道上皮细胞凋亡的研究进展作一综述。

1 炎症性肠病

IBD是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其临床表现以慢性腹痛、腹泻以及容易反复的黏液脓血便为主[1]。该病多发生于青少年，欧美国家发病率较高。但随着中国经济的发展以及人民生活方式的改变，溃疡性结肠炎在我国的发病率也不断增加[2]。

IBD的病因尚不明确，多数学者认为，IBD是多因素综合作用导致的。有报道指出超过160个基因位点与IBD相关[3]。肠道菌群失调以及肠道免疫异常也在IBD发病中具有重要作用和地位。

IBD目前的药物治疗包括氨基水杨酸、激素、免疫调节剂、生物制剂及靶向药物，出现严重的并发症(窦道、肠梗阻)时需要外科手术治疗，而且需要患者调整生活方式。近年来，许多研究表明干细胞移植在IBD的治疗中有着巨大的潜力。干细胞移植可调节IBD患者肠道免疫，修复肠道组织炎症损伤，重建肠道血管，进而有助于减轻患者肠道炎症。进一步研究发现，干细胞移植所发挥的作用主要在于其旁分泌，而微囊泡是其旁分泌的主要物质之一。

2 干细胞源性微囊泡可能是治疗IBD的新途径

2.1 干细胞及微囊泡

干细胞(stem cell)是具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，包括造血干细胞(hemopoietic stem cells，HSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)等。

微囊泡是由Wolf[4]在1967年首次报道，他发现的微囊泡来源于激活的血小板。微囊泡主要存在于循环系统中，主要来源于血小板[5]，少部分来自于其他血液细胞及内皮细胞[6]。有多种类型的细胞可以分泌微囊泡，例如干细胞及肿瘤细胞等。

根据微囊泡细胞内的来源及分泌机制的不同，可以将其分成细胞微粒(microvesicles，microparticles)和外泌体(exosome)。微囊泡表面携带有其来源细胞的表面粘附分子，而靶细胞正是通过特异性配体受体相互作用的方式来捕获特定的囊泡。其主要通过3种方式来影响靶细胞的生物学行为：①微囊泡可以通过特异性配体受体的相互作用直接激活靶细胞。例如，血小板源微囊泡表面的组织因子可以与巨噬细胞、中性粒细胞以及血小板表面的分子如P-选择素等相互作用，停留在这些细胞表面，并且为凝血因子的聚集提供膜表面。此外，血小板源囊泡可以直接激活内皮细胞、中性粒细胞和单核细胞并且能影响正常或癌变的造血细胞的功能。②微囊泡通过在细胞之间传递受体而发挥作用。例如，血小板源微囊泡可以将血小板表面的粘附分子CD41转移到内皮细胞[7]，进而改变内皮细胞的生物学特征。微囊泡将肿瘤细胞上的Fas配体转移到活化的T淋巴细胞，可以促进T淋巴细胞的凋亡[8]。③微囊泡可以将蛋白或多种RNA传递给靶细胞，进而影响靶细胞的生物学特性。研究发现内毒素激活的单核细胞可以通过微囊泡将Caspase-1转移至血管平滑肌细胞中，为平滑肌细胞的凋亡提供死亡信号[9]。此外，肿瘤源微囊泡可以将癌基因翻译的蛋白质转移到周围临近的细胞中[10]。肿瘤源微囊泡还可以将肿瘤细胞的mRNA转移至单核细胞[11]。

2.2 干细胞源性微囊泡或可替代干细胞移植治疗IBD

MSCs是来源于多种组织的具有多向分化潜能的干细胞，其不仅可以分化形成各种组织细胞，而且具有强大的免疫调节能力。MSCs可通过减少IFN-γ和TNF-α、增加IL-10的分泌来抑制T细胞增殖[12]；也可以通过活化吲哚胺2，3-二加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)降解色氨酸且抑制T细胞增殖，而且可以通过活化IDO和诱生型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)进而抑制T细胞的功能[13]。MSCs与T细胞(Th1、Th2)共培养时可促进T细胞向分泌抗炎因子类型的细胞转化，并增加调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)的比例[14]；且可以通过抑制活化的T细胞进入S期、诱导G0/G1静止而抑制活化的T细胞分裂[15]。MSCs可以分泌前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)抑制NK细胞的增殖及其细胞毒性[14]，通过减少IL-1、CD40和TNF-α的分泌以及分泌PEG2抑制单核细胞和树突状细胞(dendritic cells，DC)的成熟[16]。MSCs还可以抑制单核细胞分化为成熟的DC[17]，通过下调IFN-γ影响NK细胞的功能[14]。由此可见，MSCs对获得性免疫和固有免疫都有强大的调节能力。

国内外许多研究都表明MSCs对缓解IBD病情有着良好的效果。Lazebnik等[18]的临床研究发现，MSCs移植治疗后，溃疡性结肠炎患者自身免疫反应及肠道损伤黏膜的修复相较于标准治疗有着显著的提高，提示MSCs移植治疗溃疡性结肠炎可能成为一种新的治疗方式。Garcia-Olmo等[19]的一项临床一期试验也表明MSCs局部注射在治疗并发瘘管的克罗恩病上有较好的效果。

然而多项研究表明，在MSCs移植治疗中，MSCs定植到损伤组织处的数量以及分化为损伤组织处细胞的数量有限[20-21]。MSCs移植的治疗效果并不依赖于其定植到相应组织中的数目[22]。这表明MSCs移植的治疗效果可能与其旁分泌的各种因子有着密切的联系[23]。微囊泡是MSCs旁分泌产生的膜性小体。Bruno等[24]研究发现MSCs分泌的直径在80 nm～1 μm的微囊泡能保护并修复急性肾小管损伤。近年来，越来越多的研究致力于探究MSCs源性微囊泡对各种疾病的治疗作用。

实验表明，在培养外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)时，加入BM-MSCs源性的外泌体可抑制其产生INF-γ[25]。BM-MSC源性外泌体含有与免疫相关的miRNA，包括miR301a、miR-Let-7a和miR22。miR301a为NF-κB通路关键分子，与炎症反应和肿瘤迁移密切相关。体内外研究均证实微囊泡可有效转移特定的mRNAs和miRNAs，且mRNA可以在受体细胞内翻译成相应的蛋白质[26]。干细胞源外泌体还可通过上调受体细胞抗凋亡基因(Bcl2L1、Bcl2和BIRC8)，下调细胞凋亡基因(CASP1、CASP8和LTA)表达而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、血管再生，进而促进组织修复[27]。总之，MSCs源性微囊泡也具有调节免疫、抑制细胞凋亡、促进组织修复等功能，因此其可能替代干细胞移植成为IBD治疗的新途径。

3 干细胞源性微囊泡可调节IBD肠道免疫

肠道固有免疫和获得性免疫缺失或者应答异常在IBD的发病中起着关键的作用，各国学者在肠道免疫方面对IBD进行了深入而广泛的研究。多项研究[28-29]发现，IBD患者存在肠黏膜固有免疫的异常与缺失。肠黏膜内免疫细胞(B细胞、T细胞、树突状细胞、巨噬细胞和NK细胞)对肠道致病菌的异常免疫反应为IBD的重要特征[30-31]。其中肠道抗炎因子(IL-10、TGF-β等)与炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF等)的平衡失调及Treg细胞数量和功能明显不足是IBD发病的重要机制。MSCs源性微囊泡可降低实验性结肠炎小鼠组织中IL-1β，增加IL-10含量[32-33]，且可以增加共培养免疫细胞中Treg细胞的比例。

3.1 IL-1β和IL-10

IL-1β是一个由固有免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞)或非免疫细胞(如上皮细胞)分泌的多效炎症细胞因子。经炎性体活化的Caspase-1可以酶切Pro-IL-1β形成具有活性的IL-1β。分泌到细胞外的IL-1β可以与细胞表面的IL-1R1结合形成IL-1R复合体。该复合体胞内部分可募集MyD88进而磷酸化一些激酶(IRAK)。通过一系列磷酸化级联反应促使NF-κB进入细胞核，进而激活炎症相关基因。有研究发现IBD患者肠黏膜固有层内的巨噬细胞、树突状细胞及肠道上皮细胞分泌IL-1β有所增加[34-35]。肠黏膜内高水平的IL-1β与IBD患者疾病活动度密切相关[36]。此外，在IBD动物模型中也发现了高水平的IL-1β与肠炎的发生发展过程密切相关[37]，并且运用IL-1阻滞剂可以改善IBD的严重程度[38-39]。由此可见，IL-1β在IBD的发生发展中起着关键的作用。

IL-10是由免疫细胞(Th2、Th1、Treg及TH17等)分泌的多效抗炎细胞因子。其主要作用于抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)和淋巴细胞，调节Th1和Th2细胞因子的平衡，进而调节机体炎症反应；IL-10可与IL-10受体结合促进Foxp3+T淋巴细胞的增殖，进而抑制产IL-17的TH17的活化和增殖；有些活化的TH17细胞分泌的IL-10可以抑制TH17的致病效应；IL-10可有效地抑制IL-1、IL-6、IL-12和TNF等促炎因子的产生。因为IL-10具有强力的抗炎作用及免疫调节作用，所以其作用的缺失与IBD的发生有着重要的关系。全基因组相关性研究(genome-wide association studies，GWASs)揭示了IL-10和IL-10R等位基因的变异与IBD有着紧密的联系，尤其与溃疡性结肠炎的关系特别密切。有研究发现由于基因突变引起IL-10和IL-10R功能缺失与早发性IBD患儿的发病有着密切的联系[40]。甚至有研究人员用IL-10基因缺陷小鼠来做结肠炎实验模型。由此可见，IL-10在IBD的发病过程中有着重要的作用。

MSCs源性微囊泡可以通过降低炎症组织中IL-1β水平，增加IL-10的含量来调节炎症因子与抗炎因子的平衡。有实验将MSCs源微囊泡静脉注入TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠体内，ELISA检测显示实验组小鼠结肠组织中的IL-1β含量较对照组明显降低，而组织中的IL-10较对照组明显升高[33]。同样的，Fattore等[32]将MSCs源性微囊泡静脉注射入DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体内，通过RT-PCR分析发现实验组小鼠结肠组织中的IL-1β较对照组明显降低。由此可以说明，MSCs微囊泡可以调节炎症因子与抗炎因子的平衡而在IBD的治疗中有着巨大的潜能。

3.2 调节性T细胞

Treg是CD4+T细胞的亚群，在抑制机体免疫反应方面有着重要的作用。根据Treg分化发育的途径不同，可以将其分成天然型Treg(natural Treg，nTreg)和诱导Treg(induced Treg，iTreg)。nTreg是在胸腺中由部分未成熟CD4+T细胞经过活化后表达CD25发育而来的，iTreg则是由机体外周初始T细胞(naive T cell)在特异性抗原刺激下被激活分化，并在IL-2及TGF-β1作用下上调叉头翼状螺旋转录因子(forkhead box P3，Foxp3)基因表达形成，iTreg又可分为Tr1、Th3、CD8+CD28+T细胞等。Treg细胞表面有多种高表达的特异性分子，如Foxp3、CTLA-4、GITR、CD45RO等。其中Foxp3是Treg细胞特异性标志性分子，也是Treg发育和完善功能主要的调节分子[41]。

Treg是获得性免疫系统的重要组成成分，在抑制炎症反应及维持免疫平衡方面有着重要的作用。它主要通过分泌可溶性细胞因子及直接作用于其他免疫细胞这两种方式发挥免疫调节及抑制炎症反应的作用。活化的Treg可分泌大量的IL-10和TGF-β等细胞因子[42-43]，其中IL-10是重要的抗炎因子，TGF-β则可以通过调节Foxp3的表达来影响Treg的发育和功能。Treg表面的CTLA-4/CD28与APC表面的B7结合产生共刺激信号，发挥免疫调节作用，与DC表面的B7相结合可以抑制其成熟，进而产生特异性免疫耐受[44]。CTLA-4与B7的结合可以减少Th1的生成，诱导Th1/Th2分化偏移，进而促进IL-10等抗炎细胞因子的分泌。Treg还以介导致炎性CD4+T细胞凋亡来抑制炎症反应。

Treg细胞具有抑制炎症反应及调节免疫的作用，使得它在抑制肠道免疫，维持肠道免疫稳态上有着重要的地位。Treg细胞数量的减少或功能异常均可能导致IBD的发生。IL-2或IL-2Ra基因缺陷小鼠增加了患肠炎的可能，人类基因组研究也报道IL-2基因是IBD的可疑相关基因[45]。研究发现IL-2相关信号通路对维持成熟Foxp3+Treg细胞的存活是必须的，IL-2或IL-2Ra基因缺陷的小鼠外周组织中成熟Foxp3+Treg细胞数量明显减少[46]。由此推测Treg细胞数量的减少与IBD的发病有着密切的联系。来源于CTLA-4或LAG-3基因缺陷小鼠的Treg细胞在体外试验中不能有效地抑制活化的T细胞增殖，而且在体内试验中不能改善T细胞介导的慢性肠炎[47-48]。此外，实验表明Treg在治疗实验性结肠炎中也有明显效果，且体内增殖的iTreg比nTreg的治疗效果好[49]。

有研究发现脂肪来源的MSCs的外泌体能够调节T细胞的数量及功能[50]。进一步的研究将干细胞源微囊泡与PBMC共培养，发现其可以诱导Treg细胞的增殖[51]。而且有研究人员将人脐带间充质干细胞来源的外泌体与CD3/CD28单抗刺激的正常人BPMC相互作用，结果发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体可在体外明显抑制CD4+T和CD8+T细胞增殖，且可以明显诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的升高[52]。杨翔宇等[53]发现，炎性微环境中的IFN-γ可刺激脐带间充质干细胞外泌体分泌量明显增加，且IFN-γ可增强外泌体的免疫调节活性，促进外泌体升高BPMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。由此可说明，干细胞源微囊泡可能在调节Treg，特别是炎性微环境中的Treg细胞的生长增殖及功能等方面有一定的作用，进而在IBD的治疗中有着巨大潜力。

4 干细胞源性微囊泡可减轻IBD肠道上皮细胞凋亡

肠道上皮细胞在肠道消化与营养吸收中发挥着重要的作用，同时它也形成一道屏障并且具有固有免疫的作用，在保护机体抵抗外来病原物质方面发挥着重要作用。为了保持肠道屏障的完整性，肠道上皮细胞在不断地更新。肠道上皮细胞的增殖与凋亡的失衡可以导致炎症或者肿瘤等多种疾病发生。IBD患者肠道可发现大量上皮细胞凋亡。有研究发现，来自IBD患者结肠组织的细胞凋亡率高于健康患者结肠组织，且溃疡性结肠炎患者和克罗恩病患者结肠组织的细胞凋亡率没有差别[54]。蛋白质组分析显示IBD患者病变肠道上皮细胞中程序性细胞死亡蛋白8含量是对照组的7.4倍[55]。Rosen等[56]研究发现，溃疡性结肠炎与结肠上皮细胞内STAT6磷酸化增加密切相关，STAT6抑制剂可减少IL-13诱导的细胞凋亡和肠道屏障的破坏。由此可知，上皮细胞凋亡的增加是IBD的重要特征，且在IBD的发生发展中有着重要的作用。

干细胞源微囊泡可通过抑制上皮细胞凋亡而减轻IBD病变。有研究发现MSC源性外泌体含有人乳脂肪球EGF因子蛋白(milk fat globule-EGF factor 8 protein，MFGE8)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等857种蛋白质，其中具有全部7afa亚基和7β亚基20S蛋白酶体可降解损伤细胞中错误折叠的蛋白从而抑制损伤细胞的凋亡，促进细胞修复与增殖[57]。TNBS诱导的实验性结肠炎小鼠结肠黏膜中c-Caspase-3、c-Caspase-8、c-Caspase-9含量较空白对照组显著增加，尾静脉注射入干细胞源微囊泡后，c-Caspase-3、c-Caspase-8、c-Caspase-9含量均降低，且注射入微囊泡的浓度越高，其降低的就越显著[33]。Caspase的活性是用来检测细胞凋亡的标志。其在外源性细胞凋亡和内源性细胞凋亡途径都有着重要的地位。由此表明，干细胞源微囊泡可抑制实验性结肠炎小鼠肠道上皮细胞凋亡。

5 MSCs移植治疗的局限性及微囊泡治疗IBD的优势及前景

MSCs因其免疫抑制及抑制组织损伤的作用，在用于IBD等自身免疫性疾病的治疗上得到了重视。但是进一步研究发现，MSCs移植治疗在效用性和安全性上也存在着不可忽视的问题。在效用性方面，由于临床研究中MSC的剂量国际上大多采用1.4×106个/kg治疗移植物抗宿主病[58]，但是随着MSCs的培养传代，其免疫调节等功能逐渐丧失[59]，因此获得大剂量有效的MSCs仍是一个有待解决的问题。而且静脉注射MSCs治疗时，其归巢的比例很少，大部分滞留在肝脏和肺脏中，这就使得MSCs的效用大大降低。在安全性方面，病变组织的微环境对MSCs的影响尚不清楚，有研究指出MSCs在病变组织影响下极化成为促炎细胞[60]或者肿瘤细胞[61]。且有研究发现，移植的MSCs可转变为肿瘤表型进而直接或间接促进肿瘤细胞生长、转移以及肿瘤组织的血管生成[62]。总之，MSCs移植治疗在效用性及安全性上都存在着局限性。

干细胞源微囊泡与干细胞有着调节免疫、抑制组织损伤等相似的作用，但没有干细胞所具有的增殖分化等细胞学特性，其生物学特征较为稳定。此外,外泌体表面有CD55和CD59，可避免激活调理素、补体或凝血因子，因此可以在体液中稳定存在[63]。外泌体还可进入细胞内发挥作用，且可以和多种细胞相互作用，不易被灭活，是很好的药物载体[64]。Alvarez-Erviti等[65]首次应用修饰后的小鼠外泌体将外源性siRNA传递到靶细胞，成功使小鼠脑组织特定基因沉默。因为干细胞源微囊泡有这些优点，所以其在治疗IBD上值得期待。

虽然目前关于干细胞源微囊泡的研究多集中于其对组织损伤的修复作用，国内外关于干细胞源微囊泡在治疗IBD方面的研究也很少，但是随着其免疫调节等机制的进一步揭示，其在IBD的治疗上定会有很广阔的前景。

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*国家自然科学基金资助项目(No.81573784)；国家自然科学基金青年基金资助项目(No.81503416)

刘与进，男，1990年生，硕士研究生，E-mail：m201575651@hust.edu.cn

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：fanheng009@aliyun.com

R574.62

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.020

(2017-01-06 收稿)