Ⅰ、Ⅲ型胶原在绝经后盆腔器官脱垂患者阴道前壁组织中的表达

李明娥, 陈递林*, 钟 盈, 宋振坤, 王晓兰

(1暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院妇科，深圳 518020；2深圳市第三人民医院妇产科；*通讯作者，E-mail:dilin_c@163.com)

Ⅰ、Ⅲ型胶原在绝经后盆腔器官脱垂患者阴道前壁组织中的表达

李明娥1, 陈递林1*, 钟 盈2, 宋振坤1, 王晓兰1

(1暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院妇科，深圳 518020；2深圳市第三人民医院妇产科；*通讯作者，E-mail:dilin_c@163.com)

目的 通过研究Ⅰ、Ⅲ型胶原在绝经后盆腔器官脱垂(POP)患者阴道前壁中的表达，以探讨二者在POP发生发展中的作用。 方法 因POP行盆底重建术的绝经后患者37例作为研究组；以同期因宫颈病变行全子宫切除术患者21例作为对照组。采用免疫组化染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达水平。 结果 ①Ⅰ型胶原在研究组和对照组妇女阴道前壁组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。②Ⅲ型胶原在研究组阴道前壁组织中的表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 在绝经后POP妇女阴道前壁组织中，Ⅰ型胶原的含量无明显改变，而Ⅲ型胶原的含量降低，提示Ⅲ型胶原含量减少可能参与POP的发生发展。

盆腔器官脱垂； 绝经后； 阴道前壁组织； Ⅰ型胶原； Ⅲ型胶原

盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse,POP)，是一种影响中老年女性生活质量的常见疾病[1]。盆底支持结构主要由盆底的韧带、筋膜和肛提肌构成。韧带的主要成分是平滑肌和结缔组织。而盆底结缔组织的功能主要决定于其中胶原蛋白的数量、亚型比例及性质[2]。盆底结缔组织中存在着Ⅰ型和Ⅲ型胶原。胶原是目前国内外研究关于POP妇女盆底支持组织中的热点。本课题通过免疫组织化学方法对绝经后POP妇女阴道前壁组织中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达进行研究，了解POP发生发展中胶原含量的改变，以探讨POP发生发展中的相关因素。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集2010-12～2012-12在深圳市人民医院妇科收治的盆腔器官脱垂(POP)需手术治疗的绝经后患者37例作为研究组，术前均经妇科检查及经阴道三维彩超评估，并经尿动力学检查排除压力性尿失禁。手术方式选择盆底重建术。选择同期因宫颈病变需行全子宫切除手术治疗、且无盆腔器官脱垂和压力性尿失禁的绝经后患者21例作为对照组，两组患者均无子宫肌瘤、子宫内膜异位症等雌激素相关疾病，均无类风湿性关节炎、甲状腺功能疾病等影响胶原含量与代谢的疾病等，均无阴道前、后壁修补等手术史。两组患者在年龄、 绝经时间、妊娠及分娩次数、体质量指数等方面差异均无统计学意义。1.2 取材部位

阴道前壁12点处取约0.5 cm×0.5 cm大小的组织1块，立即放入10%的福尔马林溶液中固定。

1.3 主要试剂

浓缩型兔抗人CollagenⅠ多克隆抗体和浓缩型兔抗人Collagen Ⅲ多克隆抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4 免疫组化方法

阴道前壁组织在中性福尔马林溶液中固定后脱水，二甲苯透明，浸蜡后包埋并制备3 μm切片。烘烤切片，脱蜡，水化，高压加热修复，洗修复液，画线，染色(分别滴加1∶200兔抗人CollagenⅠ一抗，Collagen Ⅲ一抗)，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，封片。显微镜下观察结果，以已知皮肤胶原黄棕色染色设为阳性对照，以PBS设为空白对照。

1.5 结果判定

显微镜下胶原染色阳性区域为黄色至深棕黄色，由两名高年资病理医生阅片。按着色强度判定结果，显色不明显或无显色为阴性(-)，显色淡黄色为弱阳性(+)，显色黄色为阳性(++)，显色为深棕黄色为强阳性(+++)。

1.6 统计学处理

所有数据采用SPSS13.0统计软件进行处理， 采用t检验及Wilcoxon秩和检验。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶原蛋白免疫组织化学染色情况

HE染色状态下，可见非脱垂患者阴道前壁组织中胶原纤维排列成较规则的束状或条索状结构(见图1)。POP患者阴道前壁组织免疫组织化学染色状态下胶原纤维排列较稀疏凌乱成网状，呈现不同的染色强度，强阳性表达为棕黄色(见图2)，阳性表达为黄色(见图3)。

图1 HE染色状态下非脱垂患者阴道前壁组织中的胶原结构 (HE,×200)Figure 1 The expression of collagen in normal anterior vaginal tissue without POP (HE,×200)

图2 Ⅰ型胶原在POP患者阴道前壁中的强阳性表达 (IHC,×200) Figure 2 The strong positive expression of collagen Ⅰ in anterior vaginal tissue of POP patients(IHC,×200)

图3 Ⅲ型胶原在POP患者阴道前壁组织中的阳性表达 (IHC,×200)Figure 3 The positive expression of Collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue of POP patients (IHC,×200)

2.2 Ⅰ型胶原在POP患者阴道前壁组织中的表达

研究组37例POP患者阴道前壁组织中，阴性表达1例，弱阳性表达5例，阳性表达8例，强阳性表达23例，即37例POP患者阴道壁组织中Ⅰ型胶原总体阳性表达率为97.30%。而在21例对照组中，Ⅰ型胶原全部呈阳性表达，弱阳性表达者2例，阳性表达者5例，强阳性表达者14例，总体阳性表达率为100%。两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验表明两组之间Ⅰ型胶原表达差异无统计学意义(Z=0.407，P=0.684，见表1)。

表1 Ⅰ型胶原在绝经后研究组与对照组阴道前壁组织中的表达 (例)

Table 1 Expression of collagen Ⅰin anterior vaginal tissue of POP patients and normal controls (cases)

组别 n-++++++阳性率(%)研究组371582397．3对照组2102514100．0

2.3 Ⅲ型胶原在POP患者阴道前壁组织中的表达

在研究组37例POP患者阴道前壁组织中，阴性表达者20例，弱阳性表达者15例，阳性表达者2例，无强阳性表达者，37例研究组患者阴道壁组织中Ⅲ型胶原总体阳性表达率45.9%。而在对照组中，Ⅲ型胶原阴性表达者6例，弱阳性表达者12例，阳性表达者2例，强阳性表达者1例，总体阳性表达率为71.4%。研究组Ⅲ型胶原的阳性表达低于对照组，通过两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，Z=1.988，P=0.047，两者差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 Ⅲ型胶原在绝经后研究组与对照组阴道前壁组织中的表达

Table 2 Expression of collagen Ⅲ of anterior vaginal tissue in postmenopausal patients with POP and controls

组别n-++++++阳性率(%)研究组3720152045．9对照组216122171．4

3 讨论

随着人类预期寿命的增长及人们对生活质量要求的提高，盆腔器官脱垂(POP)日渐成为老年女性关注的疾病。近些年来随着手术器械及聚丙烯补片材料的不断改善，POP患者的手术方式也有了更好的选择。虽然已明确POP发生与妊娠、分娩、盆底支持破坏等因素相关，但其确切发病机制仍不明确，进一步研究其发病因素及机制一直是妇科领域近年研究热点。

盆底支持组织主要为相关的盆底肌、韧带及筋膜等，其主要由平滑肌细胞、成纤维细胞及胶原构成，其支持和稳定功能主要取决于细胞外基质中不同类型纤维间的相互作用，主要包括胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白，其中胶原是结缔组织的主要蛋白质成分。目前已发现数十种胶原，由不同基因编码而成。不同的胶原蛋白有不同的化学结构及免疫学特性，其中Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型胶原在组织中含量最丰富，Ⅰ型胶原直径较粗，有很高的抗张强度，起支持作用，Ⅲ型胶原直径较细，与弹性有关[3-5]。

有文献报道，POP患者盆底结缔组织中胶原含量的下降使盆底筋膜、韧带等支持结构松弛，导致了POP的发生[6]。但对胶原亚型的具体作用及机制看法不一，Ewies等[7]研究结果认为Ⅰ型胶原的含量与POP无关，而与Ⅲ型胶原含量增加有直接关系。另外，其还认为Ⅲ型胶原的上升与年龄及绝经状态无直接关系，而与POP有关，即发生POP时Ⅲ型胶原含量增加，并且认为激素替代治疗可逆转部分POP的严重程度。Gabriel等[8]研究有类似的结果，其对绝经后POP妇女的子宫骶韧带免疫组织化学染色定量分析其平滑肌及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量变化的研究发现，平滑肌及Ⅰ型胶原的含量较正常对照组表达无差异，但Ⅲ型胶原的含量明显上升，由此认为Ⅲ型胶原含量的上升与POP有关。然而Lin等[4]研究结果表明，阴道前壁脱垂妇女Ⅲ型胶原较正常对照组显著降低，且Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量与年龄呈正相关。之后Knuuti等[5]通过对绝经后妇女Ⅰ型和Ⅲ型原胶原的羧基端肽链、交联片段以及氨基酸的检测发现，绝经后POP妇女Ⅲ型原胶原的浓度显著增加。因此有关Ⅰ型和Ⅲ型胶原在POP患者中的表达及其作用目前仍存在争议，究其原因可能与实验对象、取材部位和研究方法等的不同相关。

本研究以绝经后POP患者为研究对象，采用免疫组织化学方法测定其阴道前壁组织中胶原Ⅰ、Ⅲ的阳性表达情况，研究结果显示:研究组中Ⅰ型胶原阳性表达率为97.3%，对照组中的阳性表达率为100%，两组间差异无统计学意义，与Ewies等[7]及Gabriel等[8]研究结果一致，提示Ⅰ型胶原的含量可能与POP无直接关系。本研究中Ⅲ型胶原在研究组中的阳性表达率为45.95%，在对照组中的阳性表达率为71.43%，研究组中Ⅲ型胶原的表达低于对照组，差异有统计学意义，这与Lin等[4]研究结果一致。提示Ⅲ型胶原含量的下降可能参与了绝经后POP发生发展过程。

近年来随着人口老龄化趋势及生活质量提高， POP的发生发展日益被重视。 虽确切发病机制目前尚无定论，但胶原蛋白形态结构变化及代谢表达异常无疑在POP患者疾病发生发展中发挥了重要作用，仍然需要大样本前瞻性的进一步研究。

[1] Krlin RM,Soules KA,Winters JC.Surgical repair of pelvic organ prolapse in elder patients[J].Curr Opin Urol,2016,26(2):193-200.

[2] Bildircin D,Kokcu A,Celik H,etal.Comparison of connective tissue components in the uterine ligaments between women with and without pelvic organ prolapse[J].Minerva Ginecol,2014,66(2):201-208.

[3] Barbiero EC,Sartori MG,Girao MJ,etal.Analysis of type I collagen in the parametrium of women with and without uterine prolapse,according to hormonal status[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2003,14(5)：331-334.

[4] Sun ZJ,Lang JH,Zhu L,etal.Etiological study on stress urinary incontinence and its relationship with collagen status[J].Chin J Obstet Gynecol January,2004，5(l):6-9.

[5] Moalli PA,Talarico LC,Sung VW,etal.Impact of menopause on collagen subtypes in the arcus tendineous fasciae pelvis[J].Am J Obstet Gynecol,2004,190:620-627.

[6] Weber AM,Buchsbsum GM,Chen B,etal.Basic science and translational research in female pelvic floor disorders:proceedings of an NIH-sponsored meeting[J].Neurourol Urodyn,2004,23(4):288-301.[7] Ewies AA,AI-Azzawi F,Thompson J.Changes in extracellular matrix Proteins in the cardinal ligaments of post-menopausal women with or without prolapse:a computerized immunohistomorphometric analysis[J].Hum Reprod,2003,18(10):2189-2195.

[8] Gabriel B,Denschiag D,Gobel H,etal.Uterosacral ligament in postmenopausal women with or without pelvic organ prolapse[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2005,16(6):475-479.

Expression of collagenⅠand Ⅲ of anterior vaginal tissue in postmenopausal women with pelvic organ prolapse

LI Ming’e1,CHEN Dilin1*, ZHONG Ying2, SONG Zhenkun1, WANG Xiaolan1

(1DeparmentofGynaecology,ShenzhenPeople’sHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Shenzhen518020,China;2DeparmentofGynaecology，ThirdPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:dilin_c@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of collagenⅠ and collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue of postmenopausal women with pelvic organ prolapse(POP) and to explore its role in the development and progression of POP.MethodsA total of 37 postmenopausal POP patients were enrolled as research group, and 21 postmenopausal patients without POP were chosen as control group. Immunohistochemistory was used to examine the expression of collagenⅠ and collagen Ⅲ.Results①There was no obvious difference in expression of collagen Ⅰ in anterior vaginal tissue between two groups(P>0.05).②The expression of collagen Ⅲ in anterior vaginal tissue in POP group was significantly lower than in control group(P<0.05).ConclusionIn anterior vaginal tissue of postmenopausal women with pelvic organ prolapse, the expression of collagenⅠ dose not significantly change while the expression of collagen Ⅲ is decreased. The low expression of collagen Ⅲ may play a role in the development of pelvic organ prolapse.

pelvic organ prolapse(POP); postmenopausal; anterior vaginal tissue; collagenⅠ; collagen Ⅲ

深圳市科技计划重点基金资助项目(201201012)

李明娥，女，1966-12生，博士，主任医师,E-mali:mingeli007@126.com

2016-10-10

R711.2

A

1007-6611(2017)01-0059-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.013