创伤性休克对兔肾组织不同时相NGAL、Kim-1与HSP70表达影响

刘 颖， 柳云恩， 刘学磊， 佟 周， 佟昌慈， 张玉彪， 施 琳， 丛培芳， 史秀云， 金红旭， 侯明晓

沈阳军区总医院1.急诊医学部；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

·创伤性休克·

创伤性休克对兔肾组织不同时相NGAL、Kim-1与HSP70表达影响

刘 颖1,2， 柳云恩1,2， 刘学磊1,2， 佟 周1,2， 佟昌慈1,2， 张玉彪1,2， 施 琳1,2， 丛培芳1,2， 史秀云1,2， 金红旭1,2， 侯明晓1,2

沈阳军区总医院1.急诊医学部；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳 110016

目的 探讨创伤性休克对兔肾组织不同时相中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子-1(Kim-1)与热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法 健康新西兰大白兔30只，随机分为对照组、0 h模型组、6 h模型组、12 h模型组和24 h模型组，每组6只。通过酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western-blot)与实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)测定各组兔血液、尿液及肾组织中NGAL、Kim-1、HSP70的含量与mRNA的表达变化。结果 与对照组比较，模型组各时相血液及尿液中NGAL、Kim-1及HSP70含量均升高，6 h开始增加，24 h时有所恢复，但仍为高表达，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组兔肾组织在不同时相NGAL、Kim-1及HSP70表达量均显著升高，在6 h时升高最明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NGAL、Kim-1、HSP70与创伤性休克导致肾损伤的发生和发展相关。监测血液、尿液及肾组织中NGAL、Kim-1及HSP70的变化情况，有助于对创伤性休克导致肾损伤的判断和治疗。

创伤性休克； 肾损伤； 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白； 肾损伤分子-1； 热休克蛋白70

随着社会的进步和经济的发展，交通肇事伤、自杀、职业伤等因创伤导致的死亡呈不断上升趋势[1]。严重的创伤往往伴有机体大量失血进而引起休克。创伤性休克发生时，患者有效微循环血容量急剧下降，进而导致机体发生一系列的损伤[2]。研究表明，创伤性休克患者死亡的首要原因为外伤直接导致重要脏器不可逆转的损伤，尤其是肾组织[3]。目前，虽然进行了大量相关研究，但许多问题仍未解决，尤其是创伤性休克造成肾损伤的机制仍是当前研究的关键和难点之一[4]。关于创伤性休克致肾损伤的发病机制，组织低灌注、氧代谢障碍是最为经典的理论，其他可能机制包括组织因子和弥散性血管内凝血、细胞凋亡、全身性炎症反应等[5-6]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、尿肾损伤分子-1(Kim-1)与热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)已被报道与多种肾疾病的发生、发展相关，但有关NGAL、Kim-1、HSP70在创伤性休克致肾损伤后的表达变化研究较少[7-9]。因此，本研究通过建立创伤性休克兔模型，分析创伤性休克致肾损伤后血液、尿液中NGAL、Kim-1、HSP70的变化，以及肾组织NGAL、Kim-1、HSP70mRNA的表达水平，为深入探讨创伤性休克致肾损伤的诊断与救治提供理论基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 成年健康新西兰大白兔30只，雌雄各半，体质量(3.0±0.5)kg，由沈阳军区总医院实验动物中心提供，于沈阳军区总医院动物实验中心饲养，食物及水由动物实验中心提供，确保不含会对本实验结果引起干扰的成分。实验动物随机分为对照组、0 h模型组、6 h模型组、12 h模型组和24 h模型组，每组各6只。

1.2 研究方法

1.2.1 创伤性休克模型建立 水合氯醛(0.49 mg/kg)与阿托品(0.03 mg/kg)腹腔注射麻醉。颈动脉置管并连接多道生理信号监测仪，监测动脉压力等生理信息。在血压、心率、平均动脉压监测下予2 500 g铁陀垂直砸伤兔股骨，造成双侧股骨完全性骨折。30 min后，自颈动脉快速放血，直至平均动脉压降至30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的休克水平。维持60 min后，进行液体复苏。5 min内快速回输全血，并输注等量5%葡萄糖生理盐水，兔苏醒后可自由饮水进食。

1.2.2 肾组织病理观察 各组均取左侧肾相同部位标本，置入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，脱水、透明，常规石蜡包埋切片行HE染色，光学显微镜观察动物肾病理组织形态学变化。

1.2.3 酶联免疫吸附法检测 应用NGAL、Kim-1及HSP70试剂盒(美国R&D公司)通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组兔血液及尿液NGAL、Kim-1、HSP70的表达量。将标准品按0～500 ng/L倍比稀释8份，尿液样本编号并稀释，每孔加样50 ml。按照试剂盒说明书进行后续操作，反应中止后于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的光密度(D)值。根据8个标准品的浓度及D值画出以D值为纵坐标，分别以NGAL、Kim-1及HSP70浓度为横坐标的曲线图，根据各样本的D值查找对应的浓度范围。

1.2.4 蛋白质印迹法检测 蛋白质印迹法(Western-blot)检测各组兔肾组织中NGAL、Kim-1及HSP70蛋白的表达变化。将蛋白样品加入相应比例的十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶上样缓冲液(6×Loading Buffer)，煮沸变性5 min，SDS-PAGE电泳，转膜，然后将膜移至5%的脱脂奶粉PBST缓冲液室温封闭1 h，PBST洗膜3次。加入一抗4℃孵育过夜。用PBST 洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。洗膜3次，暗室显影。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测各组兔肾组织中NGAL、Kim-1及HSP70 mRNA的表达变化。取2.0 μg总RNA，65℃变性5 min，经AMV逆转录酶42℃逆转录30 min，合成cDNA。取cDNA产物5 μl,依次加入10×PCR缓冲液(上、下游引物各50 pmol)、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、TaqDNA poly-merase 1 U，以下列条件进行扩增：94℃ 3 min,94℃ 45 s，50℃ 45 s(NGAL),52℃ 45 s(Kim-1),55℃ 45 s(HSP70)，55℃ 45 s(β-actin)，72℃ 45 s。进行30次循环后，进一步延伸，72℃ 5 min。根据基因库中序列，用引物设计软件Primer 5设计特异性引物。见表1。

表1 特异性引物序列

2 结果

2.1 肾组织病理观察 镜下观察，对照组兔肾组织肾间质无充血，肾小管边界清晰，管腔内无脱落细胞(图1a)；模型组兔肾组织则可以看见明显的肾组织水肿，肾小管扩张，上皮细胞变性坏死脱落(图1b)。结果表明，创伤性休克可致肾损伤模型肾组织病理改变。

图1 肾组织病理观察(HE染色×400；a.对照组；b.模型组)

2.2 血液与尿液中NGAL、Kim-1及HSP70检测 结果表明，与对照组比较，创伤性休克模型组各时相血液与尿液中NGAL、Kim-1及HSP70的表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，NGAL及HSP70在6 h开始显著增高，24 h时有所恢复。Kim-1的表达6 h开始升高，12 h达到最高。见表2、3。

表2 血清中NGAL、Kim-1及HSP70表达变化

表3 尿液中NGAL、Kim-1及HSP70表达变化

2.3 Western blot检测 结果显示，与对照组比较，模型组肾组织在不同时相NGAL、Kim-1及HSP70表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，NGAL、Kim-1及HSP70在6 h升高最明显。见图2、表4。

图2 Western blot检测结果

表4 肾组织NGAL、Kim-1及HSP70表达量

2.4 RT-PCR检测 结果显示，与对照组比较，模型组肾组织在不同时相NGAL、Kim-1及HSP70mRNA表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。其中，NGAL、Kim-1及HSP70在6 h升高最明显。见图3。

图3 RT-PCR检测结果(与对照组比较，①P<0.05)

3 讨论

创伤造成的急性应激状态、全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，进而造成的重要脏器不可逆转的损伤，已成为创伤性休克患者死亡的首要原因。创伤性休克致肾损伤已得到越来越广泛的关注[10-11]。

NGAL作为损伤急性期反应蛋白，在肾缺血再灌注所引起的肾小管损伤及其他原因引起的肾近曲小管细胞损伤后的高度表达已被报道[12]。此外，慢性肾病的发生也能够导致NGAL水平显著升高[13]。NGAL在创伤性休克致肾损伤时，表达情况可能与患者长期处于微炎症状态有关。NGAL能够诱导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡，以保护肾组织免于炎性细胞损害[14-15]。在创伤性休克致肾损伤模型中，能够明显检测到NGAL表达的变化，说明NGAL可为创伤性休克致肾损伤的敏感性和特异性较高的生物标记物。

Kim-1是一种正常成人肾中微弱表达的跨膜蛋白质，由334个氨基酸残基组成，首先被Ichimura等[16]在大鼠的肾组织中发现。Kim-1是受损近曲小管上皮细胞表达的黏附分子，在缺血及肾毒性损伤后，近曲小管上皮细胞中呈高表达状态[17]。据报道，Kim-1能够参与肾小管上皮细胞的早期损伤与修复，清除凋亡细胞和坏死细胞碎片，参与肾间质纤维化、黏附功能、信号转导功能、免疫反应等多个过程，有利于肾小管上皮细胞的再生及小管重构[18]。研究显示，在评估肾早期损伤中，Kim-1因其较高的敏感度、特异度而存在一定优势，但目前有关Kim-1在创伤性休克致肾损伤不同时相表达的研究较少[19]。本研究结果发现，创伤性休克致肾损伤后6 h，Kim-1的表达显著升高，到24 h虽已下降，但与正常对照组比较仍显著升高，与既往报道的肾相关疾病发生时体内Kim-1表达情况相一致[20]。因此，检测Kim-1水平可间接评价肾组织，特别是肾小管损伤情况。

HSP70是一种应激状态时表达增高的保护性蛋白质，广泛存在、结构保守[21]。HSP70可通过其分子伴侣作用，帮助蛋白质折叠及移位、防止蛋白质聚集、帮助变性蛋白质的解聚及复性、促进严重受损蛋白质的降解等。从而保护组织或细胞不受或少受伤害，在细胞保护中发挥重要的作用，是细胞生理状态下所必需[22-23]。此外，近年研究发现，HSP70表达增加后，亦可抑制细胞凋亡发生，对维护细胞的正常功能与生存具有重要作用[24]。

本研究对创伤性休克致肾损伤后不同时间点NGAL、Kim-1及HSP70的表达情况进行分析。Western blot结果表明，创伤性休克致肾损伤6 h后，兔肾组织中NGAL、Kim-1及HSP70的表达显著增加，随后有所恢复，但仍为高表达。血液、尿液及RT-PCR检测结果同样证明NGAL、Kim-1及HSP70在创伤性休克致肾损伤中异常表达情况。早期创伤性休克致肾损伤后，大量炎性因子的释放能够引起肾小管上皮细胞损伤。NGAL、Kim-1及HSP70的高表达，可能与创伤性休克引起早期肾组织病理性改变，恢复受损的肾小管上皮细胞有关[25-26]。

综上所述，NGAL、Kim-1及HSP70可作为创伤性休克致肾损伤的生物标志物，监测NGAL、Kim-1及HSP70的变化，可了解疾病的发展过程，对评估疾病严重程度及实施干预治疗可有重要的临床意义。

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Traumatic shock on the expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 in renal tissue of rabbits

LIU Ying,LIU Yun-en,LIU Xue-lei,TONG Zhou,TONG Chang-ci,ZHANG Yu-biao,SHI Lin,CONG Pei-fang,SHI Xiu-yun,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao
(Department of Emergency Medicine,Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Objective To explore the expression of neutrophil gelatinase associated lipocal(NGAL),kidney injury molecule-1(Kim-1),heat shock protein 70(HSP70)in rabbit at different time points after traumatic shock were studied to explore their possible role.Methods A total of 30 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into control group,0 hour model group,6 hours model group,12 hours model group and 24 hours model group.ELISA,Western blot and Real-time PCR were used to detect the change and expression of NGAL,Kim-1,HSP70 and their mRNA in blood,urine and nephridial tissue.Results Compared with control group,the expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 in blood and urine 6 hours increased after the traumatic shock,and then recovered at 24 hours,was still in the high expression(P<0.05).The expression of NGAL,Kim-1 and HSP70 tissues and mRNA expression in nephridial tissue of modeling groups of rabbits were also significantly elevated,and reached the highest in 6 hours(P<0.05).Conclusion Kim-1 and HSP70 are related to the occurrence and development NGAL of kidney injury in traumatic shock;monitoring the change of NGAL,Kim - 1,and HSP70 in blood,urine and nephridial tissue will help to the carry out judgment and treatment of kidney injury in traumatic shock.

Traumatic shock; Kidney injury; Neutrophil gelatinase associated lipocal; Kidney injury molecule-1; Heat shock protein 70

2013年辽宁省科技攻关(2013225089)；2012年全军十二五面上项目(CSY12J002)

刘 颖(1990-)，女，辽宁铁岭人，技师，硕士

金红旭，E-mail：hongxuj@126.com；侯明晓，E-mail:houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)01-0013-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.01.04

2016-11-21