以CK19为标记物研究pN0胃窦癌区域淋巴结微转移

张明亮，黄允宁，卢 林，李智勇，马强波，马海雁，靳丁丁，徐远义，赵 帅，封存志

·临床研究·

以CK19为标记物研究pN0胃窦癌区域淋巴结微转移

张明亮1，黄允宁1，卢 林1，李智勇1，马强波1，马海雁1，靳丁丁1，徐远义2，赵 帅2，封存志1

目的 通过检测常规病理检查结果为全部阴性的胃窦癌淋巴结CK19的表达量，证实pN0胃窦癌区域淋巴结中存在微转移，分析微转移与胃窦癌临床病理学的相关性。方法 取20例pN0胃窦癌患者经常规病理检测认为无转移的区域淋巴结蜡块99个，5例非肿瘤患者淋巴结蜡块19个，用RT-PCR检测淋巴结中K19mRNA表达，使用统计学方法分析检测结果与患者临床病理因素的相关性。结果 20例胃窦癌患者中，有5例患者(25%)共计21个淋巴结(21.2%)检测阳性，5例非肿瘤患者淋巴结中均未检测到CK19mRNA。pN0胃窦癌淋巴结CK19mRNA阳性表达与肿瘤的TNM分期呈正相关性(P<0.05),与肿瘤的部位 、大小、分化程度以及患者的性别、年龄无相关性(P>0.05)。结论 PN0胃窦癌区域淋巴结存在微转移，淋巴结微转移与肿瘤浸润深度有关，CK19mRNA检测胃癌淋巴结微转移特异性高，可以作为理想的靶基因用于检测胃窦癌微转移

pN0；淋巴结微转移；早期胃窦癌

胃窦癌是消化道常见的恶性肿瘤，临床上许多通过病理组织学检测无淋巴结转移的胃窦癌早期患者，纵然行标准胃癌根治术,但术后仍死于转移、 复发[1]。有学者对此进行研究并提出了癌症的微转移概念[2]。CK19是相对分子量最小的细胞角蛋白，是众多肿瘤标记物中常用的一种，主要表达于单层腺上皮及间皮组织中,仅在癌组织中特异表达或异常表达，而不在正常组织中表达[3]。本文旨在以CK19mRNA为标记物对pN0胃窦癌区域淋巴结进行研究，明确了常规病理检查HE染色为阴性的胃窦癌区域淋巴结微转移的存在，分析胃窦癌临床病理学与微转移学的相关性，探讨pN0胃窦癌患者胃癌根治术的淋巴结清扫范围。

1 材料与方法

1.1 组织标本的选择范围:筛选2011年10月-2013年6月宁夏人民医院胃肠外科诊断为胃窦癌并行胃癌根治术+D2淋巴结清扫术的20例患者，术前均未接受化疗、放疗，其清扫区域淋巴结经常规病理切片检查证实转移全部为阴性。筛选患者中，女性8例,男性12例；年龄45～72岁，中位年龄57.7岁。收集20例胃窦癌患者的第1、2站共99个淋巴结蜡块，每例3～6个，平均每例收集4.5个。另选5例非肿瘤患者作为阴性对照组，5例患者中，年龄最大65岁，最小40岁，中位年龄52.2岁；男性3例，女性2例。5例患者共取18个淋巴结蜡块，其中包括十二指肠穿孔、胃溃疡患者各2例，幽门管狭窄1例。

1.2 主要试剂:TRIzol试剂盒为GIBCO产品，Therom 反转录试剂盒K1622为Therom Fisher Scientific产品，琼脂糖为西班牙产品。

1.3 标本处理:取实验组及对照组患者淋巴结石蜡块，人工切片，置于无酶EP管内，-80 ℃保存，以备提取RNA。

1.4 操作及方法: ①引物的设计与合成 CK19引物序列:5′-AGTTGGATAGCGGTCCGCGCT-3′和5′-AAGTAGCTCTCCGTCGAGCT-3′，其扩增片断为460 bp；内参GAPDH的基因引物序列:5′-CACCCCGGGACCGAGGA-3′,5′-CTTCCACGCTTTCAAATGCGAAAAC-3′，其扩增片断为540 bp。上述两引物均由上海生物工程公司合成。② RNA的提取，按照TRIzol试剂盒说明书提取标本总RNA,使用紫外分光光度法鉴定RNA的含量及完整性。③逆转录(cDNA的合成)，逆转录反应体系为100 μl，AMV 8 μl、RNA 16 μl、RNasin 2 μl、Oligo (dt)4 μl、5×Buffer 20 μl、dNTPS 8 μl、DEPC-H2O 50 μl在42 ℃温箱下孵育60 min,以mRNA为模板,反转录合成cDNA。④ PCR反应，该反应体系为200 μl，MgCl2 12 μl、Taq酶2 μl、 cDNA 50 μl、GAPDH引物1 μl、dNTPs 16 μl、 10×Buffer 20 μl、K19引物4 μl、 DEPC-H2O 47.5 μl。反应体系的循环参数为94 ℃ 150 s、 58 ℃ 60 s、 72 ℃ 1 min，共40个循环，72 ℃延伸10 min。⑤ PCR产物分析，将PCR产物置于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色,应用GIS数码凝胶图象分析结果，将结果逐一记录。

1.5 统计学方法:采用SPSS 17.0统计软件，计数资料比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

20例胃窦癌患者中，第1、2站淋巴结99个，用逆转录-聚合酶链式反应法测定 CK19mRNA的表达，共有5例患者(25%)的21个淋巴结检测阳性，pN0胃窦癌淋巴结微转移的检出率为21.2%(21/99)；对照组5例患者均未检出CK19mRNA。 pN0胃窦癌区域淋巴结微转移的存在与肿瘤TNM分期呈正相关性(P<0.05),与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度、肿瘤的部位以及大小无相关性(P>0.05)，见表1。

表1 pN0胃窦癌区域淋巴结CK19mRNA 表达与病理组织学的关系

3 讨论

细胞角蛋白19是细胞角蛋白家族中被经常使用作为检测胃癌淋巴结微转移的标记物，岳欣等使用免疫组化法证实CK19的免疫组化染色是检测胃癌淋巴结微转移的敏感易行的方法[4]。现已证实CK19在大肠癌、胃癌、乳腺癌均高表达，甚至有报道CK19在胃癌中的表达接近100%[5]。本研究中的所有组织标本中，CK19mRNA 仅在胃窦癌患者淋巴结表达阳性，而在非癌症患者的淋巴结中表达为阴性，说明CK19的特异性很高，可以作为理想的靶基因用于检测胃窦癌微转移。

胃癌是导致癌症患者死亡的第二大原因[6]，尽管D2式淋巴清扫已经作为治疗胃癌患者的标准术式，但接受了标准胃癌切术后的患者，5年生存率仍然不理想(西方国家是20%，亚洲国家是60%)[7]。有学者对此进行研究，提出了癌症的亚临床转移-微转移概念，微转移是指传统的组织学检查淋巴结的1个切面不能发现或难以发现直径<2 mm的癌转移灶[8]。在本实验中，20例pN0胃窦癌患者淋巴结,经RT-PCR扩增CK19mRNA，其中5例患者的淋巴结呈阳性表达，pN0胃窦癌患者中淋巴结微转移检出率高达25%；99 个淋巴结中有21个淋巴结CK19mRNA表达阳性，其微转移检出率为21.21%。区域淋巴结CK19mRNA 表达与病理组织学关系分析表明，pN0胃癌淋巴结微转移的存在与胃癌TNM分期有相关性(P<0.05),与患者的年龄、性别、肿瘤的大小、肿瘤的分化程度以及部位无相关性(P>0.05)。本文结果表明，pN0期胃窦癌患者存在微转移，其发生率为25%；胃癌患者淋巴结存在微转移，其发生率为21.21%。

Fukagawa T等[9-10]认为即使通过免疫组化法已经发现胃癌患者存在淋巴结微转移，标准胃癌切除术加D2淋巴结清扫仍是一种恰当的治疗方法。Zeng Yong等通过Meta分析证实，淋巴结微转移与亚洲胃癌患者5年生存率有关[11]，存在淋巴结微转移的胃癌患者，5年生存率显著低于无淋巴结微转移的胃癌患者。提示临床医师应在术中注意把握清扫淋巴结的范围。我们认为，目前对于早期胃癌手术治疗，认真执行标准胃癌切除及D2淋巴结清扫是十分必要的。

[1] Youn HG，An JY，Chol MG，et al.Recurrence after curative resection of early gastric cancer[J].Annals of Surgical Oncology，2010，17(2):448-454.

[2] Isozaki.The New Age of cardiac surgery driven by tissue engineering and biotechnology[J].Medicine and Health Rhode Island，2006，89(1):6-10.

[3] 杨永栋，阿不都外力·吾守尔,王云海.MUC1mRNA和CK19mRNA在胃癌淋巴结表达的意义[J].中国微创外科杂志，2007，7(7)：697-700.

[4] 岳伦，王家伦.N0期31例胃癌患者区域淋巴结组织中CK19的表达[J].肿瘤防治杂志，2005，12：900-902.

[5] Moll R，Frankeo W.The catalog of human cytokeratin:patterns of expression in normal epithlia，tumors and cultured cells[J].Cell,1982,31:11-24.

[6] Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].International Journal of Cancer，2010，127(12):2893.

[7] Mori M，Mimori K，Inoue H，et al.Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptasepolymerase chain reaction[J].Cancer Res,1995,55:3417.

[8] 赵爱莲,李吉友,孙文清.常规检查淋巴结阴性胃癌的淋巴结微转移研究[J].中华肿瘤杂志,2000,22(3):222-224.

[9] Siewert JR，Kestlmeier R，Busch R，et al.Benefits of D2 lymph node dissection for patients with gastric cancer and pN0 and pN1 lymph node metastases[J].Br J Surg，1996，83:1144-1147.

[10] Fukagawa T，Sasako M，Mann GB，et al.Immunohistochemically detected micrometastases of the lymph nodes in patients with gastric carcinoma[J].Cancer，2001，92(4):753-760.

[11] Zeng Yongji，Zhang Chundong，Dai Dongqiu.Impact of lymph node micrometastasis on gastric carcinoma prognosis:a meta-nanlysis[J].World Journal of Gastroenterology，2015，21(5):1628.

Study on the lymph node metastasis of gastric antrum carcinoma in PN0 with CK19 marker

ZHANGMingliang1，HANGyunning1，LULin1，LIZhiyong1，MAQiangbo1，JINDingding1，MAJianwen1，XUYuanyi2，ZHAOShuai2，FENCunzhi1.

1.GastrointestinalSurgery，NingxiaPeople'sHospital，Yinchuan750002，China;2.ClinicalCollegeNingxiaofMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:HUANGYunning,Email: 641291178@ qq.com

Objective To detect CK19 of gastric antrum cancer lymph node by routine pathological examination and results were all negative.And to confirm micrometastasis was occurring in pN0 gastric antrum cancer lymph node and to explore the relevance between micrometastasis and clinical pathology of gastric antrum cancer.Methods 20 cases of pN0 gastric antrum cancer patients with regular pathological examination that there was no metastasis of lymph node paraffin block 99，five cases of non-tumor lymph node paraffin block 19，the expression of K19 mRNA was detected by using RT-PCR in lymph nodes.The correlation between the detection results and the clinical pathological factors were analyzed.Results In all of the 20 cases of gastric antrum cancer patients，there was five patients (25%) with total of 21 lymph nodes (21.2%) tested positive and five non-tumor patients tested negative.Lymph node metastasis of gastric antrum carcinoma was related to tumor invasion and depth (P<0.05)，and the age，sex，tumor size，degree of differentiation，and location of pN0 (P>0.05) were not related.Conclusion The regional lymph node of pN0 gastric antrum cancer present micrometastasis，and CK19 mRNA can be used as an ideal target gene for detection of gastric cancer with lymph node metastasis.Lymph node metastasis is related to the depth of tumor invasion.

pN0；Lymphnodemicrometastasis；Earlygastricantrumcancer

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0036

宁夏自然科学基金资助项目(NZ14163)

1.宁夏人民医院胃肠外科，宁夏 银川 7500022.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004

黄允宁，Email:641291178@ qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170112.1704.016.html

[文献标识码] A

2016-09-20 [责任编辑]李 洁