中草药联用对罗非鱼无乳链球菌作用的研究

王德强，佟延南，李芳远，刘宏伟，李忠琴

（1.海南省海洋与渔业科学院，海南海口570100；2.国家罗非鱼产业技术体系海口综合试验站，海南海口 570100；3.集美大学水产学院厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

中草药联用对罗非鱼无乳链球菌作用的研究

王德强1，2，佟延南1，2，李芳远1，2，刘宏伟3，李忠琴3

（1.海南省海洋与渔业科学院，海南海口570100；2.国家罗非鱼产业技术体系海口综合试验站，海南海口 570100；3.集美大学水产学院厦门市渔用药物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

本文利用BIOLOG自动微生物鉴定系统对所分离保存的罗非鱼致病菌株进行生化鉴定，确定为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），进而测定虎杖、五倍子、地榆、黄连、大黄、白头翁、黄芩等14种中草药单用及联用复方对该致病菌株的抑菌效果。结果表明，从14种中草药中筛选出6种中草药（中草药A、中草药B、中草药C、中草药D、中草药E、中草药F）对无乳链球菌有良好的抑制作用；随后考察此6种中草药组合成双联用、三联用及四联用复方的抑菌效果，其中双联用中的2种复方具有显著协同作用，4种复方具有协同作用；三联用中的8种复方具有显著协同作用，3种复方具有协同作用；四连用中的1种复方具有显著协同作用，1种复方具有协同作用。

罗非鱼；无乳链球菌；中草药；单用；联用

罗非鱼是海南省主要的淡水养殖品种，年养殖产量约35万t，年出口创汇上亿元。在目前高密度集约化生产过程中，罗非鱼链球菌病时有发生，据调查发现罗非鱼链球菌病的暴发可造成80%以上的病死率，经济损失惨重[1]。疾病发生时，生产者难免不得不使用一些化学药物进行防治，加之盲目的单用或混用，其结果不仅浪费成本，使疾病无法得到有效控制，而且造成了罗非鱼生理代谢障碍，病情加剧以及药物残留，水环境污染，养殖生态中的正常菌群失调，耐药性甚至多重耐药性增强，给今后疾病的控制带来更大的困难。

中草药是一种天然环保型绿色药物具有高效、毒不良反应少、安全性高、残留少等诸多优点。目前用中草药代替抗生素是水产病害防治的发展趋势[2-4]，研究中草药对致病菌的作用效果以指导合理用药越发重要，因此推广中草药防治水产动物疾病，有着极其重要的意义[5]。已有研究表明，中草药防治罗非鱼链球菌病绿色环保[6]，且具有较好的抑菌和杀菌效果[7-8]。本文选取14种具有广谱抗菌活性的中草药，研究其单方和复方对无乳链球菌的体外抑制作用，以期为罗非鱼链球菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中草药采集《中华人民共和国药典》具有抗菌、清热解毒特性的虎杖、五倍子、地榆、黄连、大黄、白头翁、黄芩、钩藤、白茱萸、龙舌草、黄柏、苦参、使君子及槟榔14种中草药用于试验。

1.1.2 菌株1株罗非鱼致病性无乳链球菌，由海南省海洋与渔业科学院淡水渔业研究所和珠江水产研究所从海南省罗非鱼主产区患病的罗非鱼脑部分离、鉴定并保存。

1.1.3 培养基酵母粉（广东环凯微生物科技有限公司），脑心浸萃液态培养基（广东环凯微生物科技有限公司）、琼脂粉（广东环凯微生物科技有限公司）、葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1生理生化鉴定运用BIOLOG自动微生物鉴定系统对所保存的罗非鱼致病性无乳链球菌进行鉴定。

1.2.2 药材预粉碎处理将所选的中药用中药粉碎机粉碎至100目左右，然后放入超微粉碎机进一步粉碎，收集超微药粉备用。在扫描电子显微镜下观察，90%以上的颗粒粒径大小在5～10μm。

1.2.3 平板稀释法采用琼脂扩散法，在复合培养基添加中药超微粉，以浓度1mg/mL开始进行两倍稀释，配置不同浓度梯度的药敏培养基。将无乳链球菌接种至斜面，35℃培养24 h后，使用无菌水将其洗下，并调节菌液浓度调至107CFU/m L，取菌液2μL以涂布的方法接种在经过121℃20 min灭菌后的药敏培养基平板上，每个药物浓度梯度做三组平行。将接种好的平板放置35℃培养，分别记录为该菌株的最低抑菌浓度（MIC）值，48 h后观察药板上菌落的生长情况最低杀菌浓度（MBC）值。

1.2.4 中草药双联用抑菌试验根据中药单用的数据结果选出了6种中药进行中药双联用复方的筛选。

试验组：以复合培养基为溶剂，用琼脂稀释法，采用棋盘交叉法，将参与双联用的两种中药的单用最低抑菌浓度1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC，两两混合配比制备双联用药敏培养基。

对照组：联用的两种中药的单用MIC的药敏平板作为单用药物的对照。

1.2.5 中草药三联用抑菌试验根据双联用的基础跟第三种中药进行联用。

试验组：以复合培养基为溶剂，用琼脂稀释法，采用棋盘交叉法，将参与三联用的三种中药的单用最低抑菌浓度1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC，先双联用，再与第三种中药进行双联用的混合配比制备三联用药敏培养基。

对照组：联用的三种中药的单用MIC的药敏平板作为单用药物的对照。将细菌接种至斜面，35℃培养24 h后，使用无菌水将其洗下，并调节菌液浓度调至107CFU/mL，取菌液2μL接种在经过121℃20 min灭菌后的药敏培养基平板上，每个药物浓度梯度做三组平行。

1.2.6 中草药四连用抑菌试验根据三联用的基础跟第四种中药进行联用。

试验组：以复合培养基为溶剂，用琼脂稀释法，采用棋盘交叉法，将参与四联用的四种中药的单用最低抑菌浓度1/32 MIC、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC，先三联用，再与第四种中药进行双联用的混合配比制备中药四联用药敏培养基。

对照组：联用的四种中药的单用MIC的药敏平板作为单用药物的对照。

1.2.7 联用指数（FIC）计算

①FIC指数计算：

FIC指数=MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用

②指数判读方法：

FIC≤0.5为显著协同作用，FIC＞0.5～1为协同作用，FIC=1为相加作用，FIC＞1～2为无关作用，FIC＞2拮抗作用。

2 结果

2.1 菌株的生理生化鉴定

利用BIOLOG自动微生物系统进行菌株鉴定，结果为Streptococcus agalactiae（gp B）。该菌株能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、果糖、海藻糖、蔗糖，不能分解乳糖、岩藻糖、鼠李糖、肌醇、山梨醇、D，L-丝氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸和L-精氨酸，明胶和柠檬酸等指标为阴性。

2.2 中草药单用结果

14种中药采用琼脂扩散法，以浓度1mg/mL开始进行两倍稀释，根据MIC值和MBC值确定了6种单用抑制罗非鱼无乳链球菌效果较好的中药。

2.3 中药双联用结果

6种中药两两联用，有15种组合，每个中药组合，做了16种配方。六种中药的双联用总共做了480个平板。实验结果如表1所示：双联复方D1、D2显著协同作用；双联复方C1、C2、D3、F1、F2为协同作用；双联复方B1为相加作用；双联复方A1、B2、B3、D4、F3、F4、F5为无关作用。

2.4 中药三联用结果

6种中药三三联用，有20种组合，每种中药组合，做了64种配方。六种中药的三联用总共做了2560个平板。实验结果如表2所示，三联复方E1、E2、E3、E4、A1、A2、A3、A4显著协同作用；三联复方C1、E5、B1为协同作用；三联复方A5为相加作用；三联复方E6、E7、E8、B2、C2、C3、E9、A6为无关作用。

表1 15种中药双联用药敏试验结果

表2 20种中药三联用药敏试验结果

2.5 中药四联用结果

6种中药四联用，有15种组合，每种中药组合，做了256种配方。六种中药的四联用总共做了7680个平板。实验结果如表3所示四联复方E1显著协同作用；四联复方E2为协同作用；四联复方E10为相加作用；四联复方A1、A2、C1、A3、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9为无关作用。

表3 15种中药四联用药敏试验结果

3 讨论

3.1 中药单用体外抑菌效果分析

近年来，在水产养殖业中中草药越来越多的被用于提高水产动物营养、防治疾病和提高机体免疫力等方面。特别是防病方面，因中草药具有毒性低、毒不良反应小、不易产生抗药性等特点，已成为替代抗生素类药物的首选。药理学研究表明，单味中药在抑制鱼源病原微生物上有独特的功效，并且是水产养殖病害防治用药的基础，已有不少学者采用不同方法研究了中药对水产动物病原菌的体外抑菌效果。本研究首先从虎杖、五倍子、地榆等14种中草药中筛选出抑制作用较好的中草药单方，结果表明有6种中草药抑制效果较佳。研究结果与某些文献报道结果一致，如张彬等[7]报道了金银花、黄芩、大黄、连翘、黄柏对罗非鱼海豚链球菌具有一定的抑菌作用。吴颖瑞等[8]报道了博落回、紫草、田基黄、补骨脂、三颗针、田七须、五倍子对无乳链球菌和海豚链球菌均表现出一定的抑菌活性。

3.2 中药联用体外抑菌效果分析

针对中药联用所产生的协同或拮抗作用，目前大多数学者认为是由于中药的有效成分不同、抑菌机制不同造成。将两种抑菌作用途径或靶点不同的中药联用，就可以多位点、多途径攻击致病细菌的细胞，提高药物的杀伤力。中药联用产生拮抗减效的原因可能是每种中药发挥药效的化学成分在联用时，发生多种有效成分相互结合、吸附等物理作用，从而降低药物的溶出、吸收，甚至发生化学反应，导致药物失去原有的抑菌活性。

从中医药学角度来说，中药讲求的是药物的组方配伍，通过合理的配伍可以增强原有的功用，如何明等[9]发现中药复方制剂抑制作用优于单味中药。因此，本研究分别研究了单用效果较好的6种中药的双联用、三联用和四连用复方，根据不同配伍选出了抑菌效果更佳的2种双联用复方、8种三联用复方和1种四连用复方，可见，科学配伍不同的药物组成复方制剂，能明显的提高疗效。

本试验虽然筛选出了对罗非鱼无乳链球菌有较好抑制作用的中草药单方和复方，但中草药有效成分的分析和能否开发为有实际应用价值的水产药物仍需进一步深入研究。

[1]曾凡美.罗非鱼链球菌病重在防治——“罗非鱼链球菌病流行风险分析与对策研讨会”广州[J].海洋与渔业，2009（11）：16-17．

[2]何爱华，张曦，陶琳丽，等.6种中草药对4种淡水鱼致病菌体外抑菌作用的研究[J].南方水产科学，2011，7（2）：73-76. [3]童国忠，石亚素，马剑茵，等.中草药对海水养殖黄鱼病原弧菌抑菌效果研究[J].水产科学，2007，26（8）：436-439.

[4]郑天伦，王国良，金珊．网箱养殖大黄鱼弧菌病的中草药防治[J].水产科学，2005，24（2）：24-25.

[5]程志斌，葛长荣，韩建众.中草药有效成分对动物免疫系统功能的影响及其应用[J].动物科学与动物医学，2002，19（1）：11-13.

[6]温周瑞，裴家田，王文博，等.一种中草药复方制剂对罗非鱼非特异性免疫力的影响[J].大连水产学院学报，2009，24（2）：136-140．

[7]张彬，黄婷，陈福艳，等.10种中草药及4种组方对罗非鱼致病性海豚链球菌体外抑菌试验[J].淡水渔业，2011，41（5）：35-39.

[8]吴颖瑞，龚庆芳，方宏，等.153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性研究[J].西北农林科技大学学报.2013，41（1）：25-32.

[9]何明，张永跟.中药抑菌作用研究现状[J].北京中医药大学学报：中医临床版，2007，14（6）：44-46.

新疆巴里坤县卤水淡化试养对虾首次获得成功

2016年12月1日，记者在巴里坤县海立德水产养殖专业合作社养殖基地看到，卤水淡化后工厂化养殖南美白对虾首次获得成功，填补了哈密地区对虾养殖的空白，令人兴奋的是，地处内陆深处的巴里坤人在今年春节可以吃到当地产的海产品。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社技术总监张建波介绍，11月12号投的这茬苗，从P5的苗到现在一共是19 d了，现在大的能有3 cm，小的也有2 cm，应该说试养成功了。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社理事长盛军先是江苏省连云港市人，来哈密市创业工作已30多年，涉足过许多行业。当他看到近年来兴起的工厂化海产品养殖项目纷纷获得了良好的效益，而且了解到农业设施化、水产养殖工厂化是当今低碳、环保的国际大趋势，盛军先毅然决定在巴里坤县投资创办海产品养殖。巴里坤湖是咸水湖，盛产卤虫，卤虫是养殖对虾最好的饵料。盛军先提取了巴里坤湖的水样，历时一年多，先后在哈密市环保局、地质六大队、中国水产科学研究院黄海水产研究所等地进行了全项目分析检测，结果显示湖水水质优良，水中的各种微量元素完全适合海产品养殖，而且不含重金属。盛军先邀请专家实地进行了考察，又在国内各水产品养殖基地进行了深入考察和市场分析，与中国水产科学研究院黄海水产研究所签订了合作协议，由黄海水产研究所提供技术支持，实施了“卤水淡化海产品养殖西北示范基地”项目，开始尝试海产品的养殖。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社理事长盛军先说，新疆的市场是很大的，而且养的是纯的海鲜，这个海产品的口感和淡水养殖的水产品的口感那是不一样的，所以他对这个市场很有信心。

2016年5月，盛军先注册成立了巴里坤海立德水产养殖专业合作社。在距离巴里坤湖1.3 km远的海子沿乡尖山子修建了2座1 000m2的养殖车间以及配套设施，完成投资300多万元。11月12号，合作社放养了第一批南美白对虾苗种。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社理事长盛军先说，今年这一批虾看这个长势，春节绝对可以丰富我们哈密人民的餐桌，长势良好。

海立德水产养殖专业合作社计划一期项目投资1 300万元，除了养殖南美白对虾，还计划养殖多宝鱼、梭子蟹等。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社理事长盛军先说，明年大概还要投资1 000万，有3个池子，其中有一个大池子，中间搞一个观光通道，让客人来了从观光通道可以很直观的看到，就像那个水族馆一样，透明的，可以看到虾、多宝鱼、梭子蟹在水里头游。

一期项目完工后，海立德水产养殖专业合作社对虾、多宝鱼、梭子蟹的年产量将预计达到100 t、50 t和30 t。在合作社发展的同时，盛军先还打算带动更多的当地农牧民一同致富，海产品养殖将成为巴里坤农牧民增收的一条新途径。

巴里坤海立德水产养殖专业合作社理事长盛军先说，我们这个项目也是个创新，会给我们合作社带来很好的经济效益，并且它将带来更大的是社会效益，周围环湖四个乡镇的农牧民跟着我们来做，就能够实现增收致富。对愿意参加我们合作社的这些农牧民技术指导，或者让他干脆入股这种方式，我们来带着他走这条路。

（www.bbwfish.com）

Study on combination of Chinese herbalmedicin against tilapia streptococcus disease in vitro

Wang Deqiang，Tong Yannan，Li Fangyuan，Liu Hongwei，Li Zhongqin
（1.Hainan Academy of Ocean and fisheries Sciences，Haikou 570100，China；2.National tilapia indu s t r ial t ech nolo gy sys t em，H ai k ou S tatio，H ai k ou 570100，Ch ina；3.E n g in eer in g Tech nolo gy Rese a rch Ce nt re o f F i sheryme di c in e f o rX ia me n，X ia me n 361021，Ch ina）

The pathogenic strain isolated from tilapia was identified asStreptococcus agalactiaby BIOLOG system.Then fourteen kinds of Chinese herbalmedicines such asPolygonum cuspidatum，Rhus chinensisMill，Sanguisorba officinalis，Coptis chinensisFranch，Rheum officinaleBaill，Radix Pulsatillae Chinensis，Baical Skullcap Root were chosen for the bacteriostasis test.The results showed herbs A，herbs B，herbal C，herbal D，herbs E and herbal F had obvious inhibiting effect.Then we investigated antibacterial effect of this six kinds of Chinese herbal medicine in combination with a double-linked，triple-linked and quadruple-linked.Among them，there is 2 kinds of double-linked with having significant synergies and 4 kindswith having synergies;thereis 8 kinds of triple-linked with having significant synergies and 3 kindswith having synergies;there is 1 kind of quadruple-linked with having significant synergies and 1 kind with having synergies.

tilapia；Streptococcus agalactia；Chinese herbalmedicine；alone；combined with

Q176

：A

：1004-2091（2017）01-0047-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.010

2016-03-14）

海南省海洋与渔业厅项目；福建省教育厅项目（JA15260）

王德强（1957-），高级工程师，主要从事海淡水渔业育种及养殖研究.E-mail：wangyq789@163.com

李忠琴，副教授.E-mail:zhqinli@jmu.edu.cn