香菇、金针菇、黑木耳多糖的提取与测定

杜娟+时文静

摘要：以香菇、金针菇及黑木耳3种常见食用菌为主要原料，研究了食用菌多糖的提取条件和测定方法。采用热水浸提、乙醇沉淀的方法提取多糖，然后运用苯酚-硫酸法测多糖含量。分别从液料比、浸提温度、浸提时间、乙醇浓度进行了单因素试验，在此基础上，设计L9（34）的正交試验，得出3种食用菌多糖提取的最优组合。结果表明，影响香菇和金针菇多糖提取的主次因素是一致的，依次为浸提温度、乙醇浓度、液料比；而对于黑木耳，液料比是最显著的影响因素，其次为乙醇浓度、浸提温度。最终测定的多糖含量香菇最高，为3.51%；其次为黑木耳，为3.50%；最低是金针菇，为2.94%。

关键词：香菇；金针菇；黑木耳；多糖；提取；苯酚-硫酸法

中图分类号： R284.2文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0347-03

食用菌中的多糖类物质是增强免疫活性和抗衰老的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒、抗突变、抗辐射和降血压等功能[1]。从食用菌中提取的多糖可作为配料添加到食药保健品中，不仅没有毒副作用，而且还能提供功效高、质量好的产品。现代医学研究发现，食用菌中显著增强癌症患者抵抗力的生理活性物质即为食用菌多糖[2]。香菇、金针菇、黑木耳都是日常生活中常见的食用菌，均含有十分丰富的多糖物质。香菇多糖是一种天然人体免疫调节剂，具有调节人体免疫系统、抗病毒、抗感染以及延缓衰老等作用；金针菇多糖不仅能有效提高人体免疫力，而且还有抗感染、抗氧化、保肝保湿、辅助改善记忆和缓解体力疲劳等保健作用[3]；木耳多糖同样是一类重要的活性物质，在抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等方面均有一定的生物活性。本研究主要以香菇、金针菇、黑木耳为原料，利用水提醇沉法提取多糖，并对提取条件进行优化，分别从液料比、浸提温度、浸提时间、乙醇浓度进行单因素试验，在此基础上设计正交试验，以确定最佳提取条件。最后运用苯酚-硫酸法测定多糖含量，并验证此方法的可行性。

1材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜香菇、金针菇、黑木耳购于丹尼斯超市。S2F-06A粗脂肪测定仪，上海洪纪仪器设备有限公司生产；7720N可见分光光度计，济南海能仪器股份有限公司生产。

1.2食用菌多糖的提取方法

将购买的新鲜香菇、金针菇、黑木耳洗净，然后放入烘箱中60 ℃烘干，待完全干燥后取出，于组织捣碎机中粉碎，过60目筛，置于干燥器中待用。

分别称取干燥后的香菇、金针菇、黑木耳子实体粉末 10.00 g，用脂肪抽提器石油醚回流抽提除去脂肪，残渣挥干溶剂后，加入95%乙醇90 ℃回流提取2次，每次1.5 h，离心，挥干溶剂。将残渣分别用300 mL（料液比1 ∶[KG-3]30）蒸馏水浸泡，水浴温度95 ℃，浸提2 h，提取2次。合并提取液并将其浓缩至30 mL左右，用氯仿萃取3次，以除去蛋白质。过滤后，向滤液中加入3倍体积的95%乙醇醇析，静置过夜，多糖沉淀，过滤。滤饼分别用无水乙醇10 mL洗2次、用乙醚 10 mL 洗2次，60 ℃烘干至恒质量，即得粗多糖样品。

1.3食用菌多糖提取的因素研究

1.3.1单因素试验选择不同液料比，分别为20、25、30、35、40 mL/g，进行多糖提取，比较液料比对多糖提取率的影响；控制浸提温度分别为80、85、90、95、100 ℃进行多糖提取，比较温度对多糖提取率的影响；选择浸提时间分别为1、2、3、4、5 h进行提取，比较时间对多糖提取率的影响；选择乙醇浓度分别为75%、80%、85%、90%、95%进行醇析沉淀，比较乙醇浓度对多糖提取率的影响。

1.3.2正交试验设计根据单因素试验结果，从液料比、浸提温度、乙醇浓度这3个因素进行正交试验，从而进一步确定最优的提取条件。

1.4.1葡萄糖标准溶液的制备准确称取在105 ℃下干燥至恒质量的分析纯葡萄糖对照品100 mg（称准至0.000 2 g），加水溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容，配制成1 mg/mL的标准溶液。再取25 mL 1 mg/mL的标准溶液用水定容至 500 mL，使得溶液浓度为50 μg/mL。

1.4.2标准曲线的绘制吸取葡萄糖标准溶液（50 μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL于7支具塞试管中，各用蒸馏水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚溶液1.0 mL及浓硫酸5.0 mL，摇匀，于沸水浴中加热10 min，冷却，于490 nm波长测定吸光度，以吸光度（D）为纵坐标，葡萄糖浓度（C）为横坐标作标准曲线，求得回归方程。

1.4.3换算因子的测定[4]准确称取60 ℃干燥至恒质量的香菇、金针菇、黑木耳粗多糖各0.1 g，加入适量水溶解后转移至500 mL容量瓶中，定容，作为多糖储备液。准确吸取上述溶液1.0 mL，按“1.4.2”节操作方法测定吸光度，由回归方程计算出粗多糖溶液中葡萄糖的浓度（C0）。按下式计算出换算因子：

[JZ（]f=m/（C0D0）。[JZ）][JY]（1）

式中：m为粗多糖质量（μg）；C0为粗多糖液中葡萄糖的浓度；D0为粗多糖的稀释倍数。

1.4.4样品溶液的制备精确称取香菇、金针菇、黑木耳粗多糖样品粉末各0.1 g，置于烧瓶中，加95%乙醇100 mL，90 ℃ 提取1 h，过滤，滤饼用95%热乙醇洗涤数次，然后将滤饼连同滤纸一起放入烧瓶中，加入100 mL蒸馏水，100 ℃提取1 h，过滤，滤饼用热蒸馏水洗涤数次，洗液并入滤液，冷却后转移至500 mL容量瓶中，定容，摇匀备用。

1.4.5多糖含量的测定准确吸取上述样品溶液1.0 mL于具塞试管中，按“1.4.2”节方法操作，测定样液中葡萄糖的含量。平行测定3次，由回归方程计算样液中葡萄糖的含量，按下式计算样品中多糖的含量：

[JZ（]多糖含量=（C·D·f/m）× 100%。[JZ）][JY]（2）

式中：C为样品溶液中的葡萄糖浓度；D为样品溶液的稀释倍数；f为换算因子；m为样品的质量（μg）。

1.4.6稳定性试验分别取3种样品溶液适量，按“1.4.2”节方法，测其吸光度，每隔30 min测1次，连续测定6次，记录结果。

1.4.7精密度试验分别取3种样液适量，按“1.4.2”节方法，重复测定吸光度5次，记录数据。

1.4.8回收率试验取3种多糖样品溶液1.0 mL于3支试管中，分别加入0.1 mL葡萄糖标准溶液（50 μg/mL），按“1.4.2”节方法，测其吸光度，重复操作3次，计算回收率。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1液料比对食用菌多糖提取率的影响不同液料比下所得提取率见图1，在10～40 mL/g范围内，随着液料比的增加，3种食用菌多糖的提取率均是先增后减，且在液料比为 30 mL/g 时，香菇多糖和金针菇多糖的提取率较高，而黑木耳多糖则是在35 mL/g左右。这主要是因为液料比在一定 程度上决定了多糖的提取率，当其过低时会导致多糖提取不充分，而过高时又不易提取，因此选择合适的液料比至关重要。

2.1.2浸提温度对食用菌多糖提取率的影响不同浸提温度下测定的多糖提取率见图2，随着温度的上升，多糖的提取率也呈上升趋势。这是由于浸提温度较低时，溶质的渗透能力和溶解能力也比较低，不利于多糖的浸出，从而导致多糖的提取率较低。但在90 ℃后变化很小，故90 ℃左右为较佳温度。

2.1.4乙醇浓度对食用菌多糖提取率的影响不同乙醇浓度下所得多糖提取率见图4，结果表明，多糖提取率随着乙醇浓度的升高而上升，在95%的浓度下提取效果较好。这与乙醇沉淀多糖的原理是相通的，即通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖，乙醇浓度越大，多糖的沉淀率越高。

2.2正交试验结果

2.2.1香菇多糖的提取从表2可以看出，处理组合A2B3D2提取率最高，為2.16%。通过极差分析，A、B、D 3个因素中浸提温度为最主要因素，其次为乙醇浓度，最后是液料比[CM（25]，比较k值得最优组合为A2B3D3，进行试验得提取率为[CM）]

2.29%，高于A2B3D2条件下的提取率，故香菇多糖的最佳提取条件为A2B3D3，即液料比为30 mL/g，温度为92 ℃，乙醇浓度为95%。

2.2.2金针菇多糖的提取从表2可以看出，处理组合A2B3D2，提取率最高，为3.03%。通过极差分析，3个因素对提取率的影响大小依次为浸提温度、乙醇浓度、液料比，理论上最佳提取条件为A2B3D3，经验证得，A2B3D3条件下的提取率为3.27%，高于3.03%，故金针菇多糖的最佳提取条件为A2B3D3，即液料比30 mL/g，温度92 ℃，乙醇浓度95%。

2.2.3黑木耳多糖的提取从表2可以看出，处理组合A3B2D3提取率最高，为2.52%。通过极差分析，3个因素对提取率的影响为液料比>乙醇浓度>浸提温度，最佳提取条件为A3B3D3，进行试验得提取率2.49%，低于2.52%，表明A3B2D3组合才是木耳多糖的最佳提取条件，即液料比 32 mL/g，温度90 ℃，乙醇浓度95%。

2.3食用菌多糖含量的测定

2.3.1[JP3]葡萄糖标准曲线的绘制求得回归方程C=24.08×D+0.011，r=0.990。式中：C为葡萄糖浓度，D为测定的吸光度。

2.3.2换算因子的测定本试验中测得的换算因子为f香菇=3.427，f金针菇=3.046，f黑木耳=7.192。

2.3.3多糖含量的测定结果从表3可以看出，3种食用菌多糖含量的测定结果，香菇中多糖含量最高，其次为黑木耳，金针菇多糖含量最低。

3结论

影响香菇、金针菇多糖提取率的主次因素是一致的，依次为浸提温度、乙醇浓度、液料比； 影响黑木耳多糖提取率的最显著因素为液料比，然后依次为乙醇浓度、浸提温度。正交试验结果，香菇、金针菇在液料比30 mL/g、浸提温度90 ℃、乙醇浓度95%的条件下提取率较高，黑木耳多糖的最佳提取条件则是液料比32 mL/g、浸提温度90 ℃、乙醇浓度95%。在对多糖含量的测定试验中，通过稳定性试验、精密度试验及回收率试验，表明苯酚-硫酸法简单易行，结果可靠，是较好的测定方法。3种多糖含量的测定结果由高到低依次顺序为香菇、黑木耳、金针菇。

参考文献：

[1]郭春沅. 真菌多糖的免疫调节作用[J]. 中国食用菌，2000，19（3）：6-7.

[2]周日宝. 湖南药用真菌的研究[J]. 湖南林业科技，1994，21（3）：55-59.

[3]刘孝永，陈蕾蕾，裘纪莹，等. 金针菇多糖研究进展[J]. 中国食物与营养，2012，18（5）：63-67.

[4]钟世红，卫莹芳，古锐，等. 苯酚-硫酸比色法测定红毛五加皮多糖的含量[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：266-267.