重庆巫溪烟区烟草赤星病病原鉴定

夏茜��+唐梅��陈益银��

摘要：为明确重庆市巫溪烟区烟草赤星病病原菌的种类，从重庆市巫溪县通城烟站不同田块采集烟草赤星病典型病斑，分離病原菌并进行鉴定。结果显示，分离到1株优势致病菌株Tb-wx-1，被证明是烟草赤星病病原菌，经对致病菌株的rDNA-ITS 区序列进行测序，确定为细极链格孢（Alternaria tenuissima），这是首次在重庆烟区发现细极链格孢引起烟草赤星病。

关键词：重庆市；巫溪烟区；烟草赤星病；rDNA-ITS；细极链格孢

中图分类号： S435.72文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0181-03

烟草属于收获叶片的作物，在我国经济中占有比较重要的地位。烟草病害发生后对烟叶产量与质量影响很大，严重时会造成毁灭性的损失。目前，烟草赤星病是严重制约我国烟叶生产的一类真菌病害，该病具有潜育期短、暴发快的特点，在温湿度适宜的条件下，短时间内即可大面积流行，给烟叶生产造成巨大损失[1]。

烟草赤星病的病原属半知菌亚门链格孢属，其寄主范围较广，烟草、棉花、花生、大豆等均可被其侵染并产生病斑[2]。早在1892年就有研究人员将该病害病原命名为 Macrosporium longipes Ell. & Ev.。1928年Mason将其修改为Alternaria longipes （Ell. & Ev.） Mason[3]。1971年Lucas 提出Alternaria longipes 与 Alternaria alternata （Fr.） Keissler在形态上相同[4]。直到1998年张天宇等主张将烟草赤星病菌学名确定为Alternaria alternata （Fr.） Keissler，并认为鉴于其对烟草有明确的致病性，建议将其定名为链格孢烟草专化型[Alternaria. alternata （Fr.） Keissler f. sp. nicotianae][5]。2004年彭希文等对云南地区的12株烟草赤星病菌菌株进行鉴定，通过培养性状及形态特征确定属于长柄链格孢菌（A. longipes）和链格孢菌（A. alternata）[6]。2007年关博元对重庆多个烟区采集到的55株烟草赤星病菌菌株进行鉴定，确定均为链格孢菌（A. alternata）[7]。2012年胡中会等对云南地区28份烟草赤星病菌菌株的rDNA-ITS序列进行分析，经鉴定确定属于小孢子种[8]。2013年祖艳青等对河南烟区的赤星病病菌进行鉴定，从形态学上鉴定为链格孢（A. alternata）、长柄链格孢（A. longipes）和鸭梨链格孢（A. yaliinficiens），其中首次报道了鸭梨链格孢（A. yaliinficiens）可以引起烟草赤星病[9]。

近几年来，重庆巫溪烟区赤星病病害较为严重，烘烤期大量叶片发病，造成烟叶烘烤后不可用，减产严重。为确定巫溪烟区赤星病病原的种类，笔者采集田间发病病叶，对赤星病致病菌进行室内分离并进行初步鉴定，为研究赤星病的发生规律、提出有效防治方法奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

2014年9月自重庆市巫溪县通城烟站不同的田块采集带有烟草赤星病菌典型病斑的病叶，带回实验室，并在实验室内分离致病菌株。供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：去皮马铃薯200 g，琼脂20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水定容至1 000 mL）。

1.2方法

1.2.1致病菌株分离样品首先采用组织分离法[10]。选取带有典型赤星病病斑的叶片，清水冲洗干净后，在病健交界处切下0.2 cm×0.2 cm大小的组织块，在75%乙醇中消毒 10 s，无菌水连续漂洗3次，再用灭菌滤纸除去多余水分，置于固体PDA培养基上，25 ℃恒温培养，待长出菌丝后作菌种纯化用。

1.2.2致病菌株纯化采用稀释纯化法[10]，取初分离的培养菌丝置于加入无菌水的离心管中振荡，分离菌丝上的孢子，取1 μL进行镜检，并调整其浓度，在PDA平板上加入20 μL已配制好的孢子悬浮液，涂板后于25 ℃恒温培养。当平板上形成单个菌落，挑取菌落转接到新的PDA平板上培养以获得分离物的纯培养，纯化的菌种于4 ℃保存备用。

1.2.3致病性测定采用离体组织接种法。将病原菌在PDA平板上于25 ℃恒温培养后，用灭菌枪头在菌落的边缘打取菌饼。取K326烟草新鲜健康烟叶，用75%乙醇棉球对叶片表面消毒，无菌水冲洗3次。将菌丝块贴于烟叶叶片背面，接种后的烟叶置于消过毒的保鲜盘内，叶片处于保湿状态，置于25 ℃室温培养箱内保湿培养12 d，观察烟叶叶片发病情况。

1.2.4致病菌的形态学鉴定观察致病菌在PDA平板上的菌落特征，显微镜下观察菌丝体、分生孢子等的形态特征，对其进行形态学鉴定。

1.2.5致病菌的分子生物学鉴定采用CTAB法提取致病菌基因组DNA[11]。以基因组DNA 为模板，用真菌核糖体基因转录间隔区ITS通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。

2结果与分析

2.1致病菌株的分离纯化

于重庆市巫溪县通城烟站不同的田块采集带有烟草赤星病菌典型病斑的病叶20份，带回实验室，采用常规方法进行病原菌分离，在25 ℃下培养至长出菌丝，经纯化后观察培养性状并镜检，筛选得到1株优势致病菌株，命名为Tb-wx-1，结果见图1。经平板培养，菌株菌落呈圆形，前期生长为白色菌落，后期颜色逐渐加深呈现黑褐色甚至黑色（图1-A）；其分生孢子在显微镜下观察结果见图1-B，参照《中国真菌志》第十六卷描述[12]，确定分离得到的菌株属于链格孢属（Alternaria）。

2.2致病性测定

经室内接种K326的离体叶片，从接种点处逐渐扩展，边缘有黄色晕圈，叶片发病部分变黄（图2），且从发病病斑再次分离到同一种菌株。

2.3致病菌株的分子生物学鉴定

2.3.1致病菌株rDNA-ITS序列多重比对采用CTAB法提取致病菌Tb-wx-1的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物直接进行测序。将得到的测序结果在NCBI上采用Blast比对分析，结果如图3所示，可见Tb-wx-1的序列与已报道的细极链格孢（Alternaria tenuissima）序列同源性最高，相似性达100%。在GenBank中下载已发表的部分链格孢rDNA-ITS 区序列Alternaria tenuissima（HQ647307.1）、Alternaria alternata（FJ717729.1）、Alternaria longipes（AY751457.1）、Alternaria yaliinficiens（HQ238276.1），使用ClustalX软件将Tb-wx-1的序列与其进行多重序列比对，然后将得到的比对结果采用Boxshade格式化。图4结果显示，这几种rDNA-ITS 区序列相似度非常高，仅有几个核苷酸不同，Tb-wx-1与细极链格孢（A. tenuissima）序列一致。结合形态学与分子生物学鉴定结果，将该病原菌鉴定为细极链格孢（A. tenuissima）。这是首次在重庆烟区鉴定到细极链格孢（A. tenuissima）可以引起烟草赤星病。

[FL（2K2]2.3.2系统进化分析在对以上序列进行多重比对的基础上，使用MEGA5.10软件采用邻接法构建系统进化树，如图5所示，菌株Tb-wx-1与细极链格孢（A. tenuissima）同处系统发育树的1个分支，遗传距离最近；虽然与其他链格孢菌菌株的遗传关系也较近，但并不与A. alternata、A. longipes聚为1支。

3讨论与结论

赤星病作为烟叶生长后期重要的叶部真菌性病害，一旦暴发，对烟叶产业造成的损失巨大。因此，对其病原的种类进行分析有助于烟区制定有针对性的防治措施。根据以前的报道，重庆市多个烟区采集到的烟草赤星病菌菌株均为链格孢菌（A. alternata）[7]，本研究通過对重庆市巫溪烟区赤星病致病菌的rDNA-ITS序列进行测定和分析，最终鉴定为细极链格孢（A. tenuissima），在重庆地区属于首次报道，为巫溪烟区开展该病害的防治提供了科学依据。

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