24个抗瘟基因与哈尔滨市稻瘟病菌互作分析

马军韬+张国民+辛爱华+张丽艳+邓凌韦+王永力+王英+肖佳雷+任洋+宫秀杰

摘要：为明确24个抗瘟基因与哈尔滨市稻瘟病菌的互作情况，应用田间自然感病结合室内接种的方式完成试验，得出以下结论：（1）2012年有[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]Pi-sh[WTBZ][STBZ] 7个基因对稻瘟病表现免疫，2014年又新增[WTBX][STBX]Pi-km和Pi-5（t）[WTBZ][STBZ] 2个基因表现免疫；（2）Pi-i和Pi-k是植株发病率和叶片发病率上升幅度最大的基因，Pi-t和Pi-z是植株发病率和叶片发病率下降幅度最大的基因；（3）2012年病情指数最高的3个基因为Pi-z、Pi-kh和Pi-k，其病情指数分别为14.04、13.50和12.40，2014年病情指数最高的3个基因为Pi-k、Pi-a和Pi-i，其病情指数分别为65.39、33.64、29.38，叶片发病率与病情指数相关度最高；（4）从室内接种结果看，24个抗瘟基因都存在被稻瘟病菌侵染的风险，其致病性相似系数介于0.20～0.75之间。综合分析，24个抗瘟基因对稻瘟病的抗性在年际间存在波动，稻瘟病菌的致病性呈集中化趋势。

关键词：水稻单基因系；抗瘟基因；稻瘟病菌；病情指数

中图分类号： S435.111.4+1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0164-05

哈尔滨市是北方粳稻主产市之一，年种植面积超过 60万hm2，稻瘟病是该区域水稻生产上的主要病害，年均产量损失超过5.00%[1-2]。目前，当地生产上主要通过化学药剂来进行病害的防控，成本高，污染环境[3-4]，不是病害的最佳解决途径。以往的研究表明，水稻抗性品种对稻瘟病具有明显的抵抗能力，而水稻品种的抗性主要来源于其自身携带的抗瘟基因。因此，分析水稻抗瘟基因对稻瘟病的田间真实抗性，可以为抗性品种选育及品种合理布局奠定理论基础。

前人的相关研究主要集中在以抗瘟基因为鉴别体系，在分析稻瘟病菌致病性变化的同时，分析基因的抗性价值。马军韬等应用日本清泽鉴别体系对黑龙江省稻瘟病菌生理小种进行分析后认为，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi-ta2、Pi-zt[WTBZ][STBZ]可在黑龙江省优势小种区利用，Pi-ks、Pi-t不可大规模利用[5]。刘文德等分析了24个抗瘟基因对福建省稻瘟病菌的抗性情况，结果显示，Pi-kh抗性最强，抗性频率为98.15%，是优质抗源[6]。兰波等分析了30个水稻抗瘟基因品系对江西省稻瘟病菌的抗性情况，结果显示，Pi-zt和Pi-k抗性最强，抗性频率分别为85.11%和82.95%，是优质抗源[7]。此外，李湘民等也进行过类似研究[8-10]。上述研究都对解决当时、当地稻瘟病危害问题起到了积极的推动作用，但在研究方法上均采用室内接种方式，由于试验条件极为适宜，易导致试验结果偏重情况的出现；此外，由于供试菌株数量多寡及采集地点不均衡等问题，易导致菌株群体代表性不强情况的出现，造成人为误差。本研究在对外部环境进行测评的前提下，结合田间自然感病和室内接种2种鉴定方式进行分析，可以部分弥补上述不足，相对较好地反映抗瘟基因的真实抗性。

本研究以哈尔滨市道外区民主乡为试验地点，该区域地理、气候条件适中，既利于水稻连片种植，也利于稻瘟病菌定殖、扩繁，直接导致当地稻瘟病长期发生。以此为契机，本研究以区域内稻瘟病菌为试验靶标，通过田间自然感病的方式，分析了24个水稻单基因系与区域内稻瘟病菌的互作情况；通过室内接种的方式，分析了24个水稻单基因系的抗性及稻瘟病菌的致病性情况，以期为抗瘟基因综合评价及抗性未来发展趋势等研究提供基础数据。

1材料与方法

1.1试验材料

水稻单基因系，24个，各含有1个已知抗瘟基因；感病对照品种为丽江新团黑谷（LTH），不含任何抗瘟基因，由中国农业科学院作物科学研究所提供。供试菌株，18个，于2014年从哈尔滨市道外区民主乡感病水稻植株上分离获得，由黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所提供。田间自然感病菌株，为混合菌株群，分别来源于2012年和2014年哈尔滨市道外区民主乡。

1.2试验方法

水稻单基因系田间发病情况分析，采用田间自然发病方法完成试验。每个水稻单基因系播1行，15株，每行单基因系间插播1个诱发行，品种为蒙古稻，3次重复，四周保护行品种也为蒙古稻。2012年，环境条件适宜后，当年混合菌群首先在誘发品种和部分高感单基因系上完成初侵染，形成大量分生孢子后，逐步完成多次再侵染，发病完全后，按下列标准进行调查[11]。病情分为6级，即0级：叶片上无任何病斑；1级：直径小于0.50 mm的褐色病斑；2级：直径为0.50～1.00 mm 的褐色病斑；3级：直径为1.00～3.00 mm的椭圆形病斑，周围褐色，中央灰白色；4级：纺锤形病斑，直径超过 3 mm，病斑无融合或略微融合；5级同4级，但由于病斑融合，叶片上半部枯死。统计分析时，将0～3级归为抗病反应型，4～5级归为感病反应型。于2014年在相同地点、应用相同方法，以当年混合菌群为侵染源，完成重复性试验。

水稻单基因系室内发病情况分析，通过喷雾接种的方式完成。稻瘟病菌株的分离、培养及扩繁参照周江鸿等的方法[12]。幼苗以草碳土、黑土为基质，育秧盘育苗，每个水稻单基因系保苗15株，3次重复。待幼苗长至3叶1心时，搬入人工气候室，应用孢子悬浮液进行喷雾接种，悬浮液浓度为 5×105 个孢子/mL（含0.025%吐温-20），剂量为每盘 100 mL。接种完成后，在26 ℃、相对湿度100%条件下暗培养30 h，光照培养96～144 h，发病完全后按上述标准进行调查[11]。将能够给水稻单基因系植株造成4～5级伤害的稻瘟病菌株称为致病菌株，其余称为非致病菌株。

1.3数据分析

[JZ（]植株发病率=100%×（发病分蘖数/植株总分蘖数）；[JZ）]

[JZ（]叶片发病率=100%×（发病叶片数/总叶片数）；[JZ）]

叶瘟病情指数=100×∑（发病叶片数×发病级别）/（总叶片数×最高发病级别）；

[JZ（]室内发病率=100%×（致病菌株数/总菌株数）。[JZ）]

将抗瘟基因与稻瘟病菌的互作反应型作为性状，当抗瘟基因对稻瘟病菌表现抗病时记为“1”，表现感病时记为 “0”，构成二态性状。利用DPSv7.05分析软件，以类平均法进行致病性相似度聚类分析，相似系数=1-相异系数。以SNK法进行抗瘟基因间差异显著性分析，同时应用该软件进行指标间的相关分析。

应用Excel 2010进行数据统计与计算。

2结果与分析

2.1水稻单基因系田间植株发病情况分析

以当年田间混合菌株群为选择压力，对水稻单基因系植株发病情况进行了分析，结果（表1）显示：2012年，在24个供试基因中，对稻瘟病菌表现免疫的基因有7个，分别为[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和Pi-sh。在表现感病的17个基因中，其发病率介于2.58%～47.03%之间，平均发病率为19.93%。其中，[WTBX][STBX]Pi-11[WTBZ][STBZ]基因发病率最低，Pi-k基因发病率最高。此外，感病对照品种丽江新团黑谷发病严重，发病率为73.13%。

2个免疫基因。在表现感病的15个基因中，其叶片发病率介于2.21%～81.74%之间，平均发病率为18.83%，升高趋势明显。其中，Pi-zt基因发病率最低，Pi-k基因发病率最高。此外，感病对照品种丽江新团黑谷发病加重，发病率升至 90.18%。

从叶片发病率的年际变化角度分析，感病对照品种丽江新团黑谷发病明显且程度较重，证明结果真实可信。对比2012年与2014年水稻单基因系试验结果，稳定中同样存在较大波动，主要存在3种类型：（1）表现免疫的抗瘟基因，包括[WTBX][STBX]Pi-12（t）[WTBZ][STBZ]等7个基因。（2）叶片发病率降低的抗瘟基因，包括Pi-z等8个基因，其中Pi-z基因发病率下降12.04百分点，降幅最大；[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因发病率下降1.16百分点，降幅最小。（3）叶片发病率上升的抗瘟基因，包括Pi-k等9个基因，其中Pi-k基因发病率上升64.84百分点，升幅最大；[WTBX][STBX]Pi-19（t）[WTBZ][STBZ]基因发病率上升1.22百分点，升幅最小。

应用病情指数对叶瘟发生的普遍率和严重度进行了综合分析，结果（表3）显示：2012年，在24个供试抗瘟基因中，对稻瘟病菌表现免疫的基因有7个，分别为[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2和Pi-sh[WTBZ][STBZ]。在表现感病的17个基因中，其病情指数介于0.70～14.04之间，平均病情指数为5.43。其中，[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因病情指数最低，Pi-z基因病情指数最高。此外，感病对照品种丽江新团黑谷综合发病情况严重，病情指数为32.34。从抗瘟基因差异性角度分析，在0.05、0.01差异水平上，24个基因均被划分为10个差异梯度，其中Pi-kp基因与其他23个基因表现显著差异。

3讨论

稻瘟病作为一种侵染性病害，其危害程度与环境条件有直接关系。针对哈尔滨市的生产实际，每年7—9月的温度、湿度等气象因子对稻瘟病菌的侵染及循环影响较大。2012年哈尔滨市7—9月的平均气温分别为23.97、22.1、16.75 ℃，2014年7—9月的平均气温分别为23.78、2201、15.97 ℃，比较接近；而且，这2年7—9月的平均相对湿度均在70%～78%，也比较接近；整体分析，气象因子在2年间差异不大。此外，本研究中的2年试验是在同一地点、田间无明显病株残留物前提下，应用同一类型种质完成分析的，试验环境基本一致。因此，粗略认为，整体外部环境因素在年际间差异较小，病菌致病性及致病力的年际变化可能主要是内在变异或与种质互作的结果。

本研究之所以从植株发病率指标和叶片发病率指标进行稻瘟病菌分析，主要是因为这2个发病率指标可以部分代表病菌在水稻中的寄生与分布状态。植株发病率是以水稻的单个分蘖为调查基数，可部分代表病菌在水稻群体中的分布广度；叶片发病率是以水稻的单个叶片为调查基数，可部分代表病菌在水稻个体中的分布集中度。例如：3个水稻分蘖株上各有1个叶片发病和1个水稻分蘖株上有3个叶片发病，粗看结果一致，都是3个叶片发病，但实际意义不同。前者在水稻群体中分布更广，后者在水稻个体中分布更集中，一旦外界环境适应，前者可能造成分散式发病，后者可能造成有核心的扩展式发病，如果进行化学防治，前者必须全面喷洒农药方能取得理想效果，后者可能在寻找核心发病区的基础之上进行有重点的喷洒农药即可取得理想效果。由此可见，进行水稻种质2个发病率指标的分别调查有其科学性和现实指导意义。

综合24个水稻单基因系植株发病率、叶片发病率和叶瘟病情指数等指标的变化情况后认为，稻瘟病菌或抗瘟基因可能存在下列几点变异规律：（1）表现感病的抗瘟基因数量在年际间呈下降趋势，说明病菌的整体致病性可能呈集中化趋势。（2）年际间植株发病率与叶片发病率上升基因数量上多于发病率下降基因，在变化程度上前者也明显大于后者，加之感病对照丽江新团黑谷的发病率也呈明显上升趋势，侧面说明病菌的整体致病力可能呈增强趋势，同时也说明抗瘟基因群体的整体抗性可能呈下降趋势。（3）各个指标的内部差值在年际间呈扩大趋势，抗瘟基因的差异梯度在年际间呈增加趋势，说明抗瘟基因的抗性差异化趋势明显，高抗性基因与低抗性基因进一步分开。结合各个指标的信息综合评价，Pi-k、Pi-i、Pi-ta和Pi-a基因抗性丧失速度过快，建议不要应用；[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-9（t）[WTBZ][STBZ]等7个基因抗性很好且相对稳定，可以广泛应用，这一结论与兰波、李进斌和张国民等的研究结果比較类似；Pi-z基因抗性提升很快，可以有限度的应用。

从几个指标的相关度方面分析，病菌在水稻个体中的分布集中度与综合发病程度关联性最强，病菌在水稻群体中的分布广度与综合发病程度关联性较强，而发病级别与病害的综合发生程度关联性较差，这可能与2年间发病程度相对均匀有直接关系。

从水稻单基因系的室内接种结果分析，由于选择压力更大，侵染条件更加适宜，没有出现免疫抗瘟基因，各供试基因都存在或高或低的发病风险。鉴于试验菌株数量偏少，定量分析结果可能存在误差，但仍可以说明一定的问题：（1）每个稻瘟病菌株的致病型各不相同，说明来源于相同地点的菌株间仍然存在明显的致病性分化；（2）菌株彼此间致病性相似系数差值较大，说明菌株间的致病性分化程度比较剧烈；菌株间侵染抗瘟基因的数量差别较大、平均值不高，说明菌株间的致病力存在明显差别，但目前整体水平不高。

此外，鉴于水稻单基因系都存在发病风险，需进一步关注新型抗源的应用工作。目前，国内外共发现各类抗瘟基因超过100个[13-21]，但转育成水稻单基因系的明显较少[22]，多数基因由于缺乏单基因系载体而无法评价其真实抗性，从而限制了相关工作的深入开展。

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