15个生防菌株乙酸乙酯提取物对松材线虫的杀虫活性*

魏博涵 张锴 申加兴 唐慧 宋瑞清

（东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040）

15个生防菌株乙酸乙酯提取物对松材线虫的杀虫活性*

魏博涵 张锴 申加兴 唐慧 宋瑞清**

（东北林业大学，黑龙江哈尔滨150040）

筛选的15个生防菌株乙酸乙酯提取物对松材线虫的杀虫活性研究表明，淡紫拟青霉菌株PT1杀虫效果最佳，24 h、48 h和72 h校正死亡率均达到100%；木霉菌株T-28在24 h校正死亡率达到78.64%，48 h为97.12%，72 h达到100%；T-19和T-43在72 h校正死亡率分别达到63.17%，63.59%。

松材线虫；淡紫拟青霉；木霉；厚垣孢普可尼亚菌；提取物；杀虫活性

松材线虫病是一种以病原松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)为主导的，综合有人为参与、媒介天牛传播、寄主松树、树栖真菌和伴生细菌及环境因素的复杂病害系统，是松树上一种毁灭性病害，被称为“无烟的森林火灾”[1]。我国自1982年发现该病以来，现已扩展到江苏、浙江、安徽、广东、山东、湖北、香港等地，造成林业经济、森林生态上的巨大损失和自然景观的严重破坏，并对我国的松树造成巨大威胁[2,3]。目前，松材线虫的防治以化学防治为主，但由于化学防治存在易产生抗药性、污染环境、破坏生态平衡等诸多问题，因此研制开发低毒低残留、环境友好型的植物源、微生物源等生物农药日益受到重视。木霉菌（Trichoderma spp.）是一类广谱拮抗菌，能拮抗多种病原真菌，具有生产速度快、产孢量大、易培养、作用机制多的特点，是微生物农药的重要生产菌株[6]。厚垣孢普可尼亚菌（Pochonia chlamydospora）是一种即可以寄生在线虫上，又可以在土壤中营腐生生活的一种兼性寄生菌，利用其寄生线虫的特点，可研制生物菌株用于防治[7]。淡紫拟青霉菌（Paecilomyces lilacinus）是目前防治植物根结线虫的最有效生物制剂[8]，是防治植物线虫较有潜力的生物防治菌剂之一，对植物线虫卵具有较强的寄生能力[9]。鉴于此，本研究以木霉菌、厚垣孢普可尼亚菌和淡紫拟青霉菌等线虫生防菌株为研究对象，对松材线虫进行室内杀虫活性研究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株与松材线虫

木霉菌8株（T-13、T-14、T-19、T-28、T-33、T-35、T-43、T203），厚垣孢普可尼亚菌4株（PC1、PC2、PC3、PC4），淡紫拟青霉菌3株（PT1、PT2、PT3），均来源于中国林科院微生物菌株平台。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、松材线虫NXY61均由中国林科院森环森保所张星耀课题组提供。上述菌种均保存于东北林业大学森林微生物实验室，各菌株具体信息见表1。

1.1.2 培养基

试验用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）（配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL）和马铃薯葡萄糖培养基（PD）（配方：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL）。

1.1.3 试验仪器

SHB-3旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、TDL-40B台式离心机（D-37520 osterode made in Germany）、HZQ-F100恒温振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、LDZX-40AI自动型不锈钢立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、SW-CJ-2F超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、FA2004N电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

表1 研究所用菌株及来源

1.2 各菌株活性成分提取

1.2.1 发酵液的制备

用PDA培养基培养木霉菌、淡紫拟青霉、厚垣孢普可尼亚菌3属15个菌株。在超净工作台用直径为5 mm的无菌打孔器切取在PDA平板培养基上培养好的各菌株菌饼，接种于盛有250 mL PD液体培养基的三角瓶中，每瓶接种3～4片菌饼，置于摇床上（25℃，150 r/min）振荡培养10天。

1.2.2 提取菌株活性成分

收取培养10天的培养液，用4层纱布过滤，将滤液用乙酸乙酯进行萃取，比例为1∶3。萃取2天后，用分液漏斗分液得到提取液。利用旋转蒸发仪对提取液进行旋转蒸发，得到少量液体，再滴加5 mL吐温80即得到各菌株的活性成分。

1.3 线虫培养

用PDA培养基培养灰葡萄孢，放置于培养箱中（25℃）培养。

在超净工作台中接种松材线虫于灰葡萄孢中，培养10天。用400目尼龙筛布采用贝尔曼漏斗法分离线虫，4 h后用PBST（1倍）缓冲液冲洗线虫2次，在离心机（3 500 r/min，5 min）中离心去掉杂质后，用PBST缓冲液稀释线虫液，重复3次，最后收取到线虫液。

1.4 室内线虫毒力测定

用提取好的各菌株活性成分对线虫液进行毒力测定，即将各菌株活性成分150 μL及线虫液50 μL混合后置于96孔板中，重复3次，并以未滴加活性成分的吐温80为对照，处理后24 h、48 h和72 h进行观察和测定，并计算校正死亡率。

2 结果与分析

松材线虫处理后，在4倍光学显微镜下计数死亡线虫数（线虫僵直不动视为死亡）及线虫总数，综合所有提取物对松材线虫的处理图(图1～图3，其它略)，并计算其校正死亡率的结果（图4）表明，15个菌株都有一定的杀虫效果，其中淡紫拟青霉PT1的杀虫效果最好，24 h校正死亡率高达100%，48 h和72 h也分别为100%；木霉菌株T-28的24 h校正死亡率为78.64%，48 h为97.12%，72 h达到100%；T-19、T-43的72 h校正死亡率分别达到63.17%、63.59%。

图1 T-28处理后的松材线虫显微镜图

图2 PT1处理后的松材线虫显微镜图

图3 tuwen液对照组的松材线虫显微镜图

图4 各菌株乙酸乙酯液提取物杀虫效果

3 结论与讨论

采用乙酸乙酯对8株木霉菌株、3株淡紫拟青霉菌菌株、4株厚垣孢普可尼亚菌株的活性成分进行提取后，用其对松材线虫进行毒力测定结果表明，15个菌株乙酸乙酯提取物均具有一定的杀虫效果，其中淡紫拟青霉PT1的杀虫效果最好，其次为木霉菌株T-28、木霉菌株T-19和T-43。

［1］董锦艳，李国红，张克勤.真菌杀线虫代谢物的研究进展［J］.菌物系统，2001,2(2)：286-296.

［2］谢立群，赵博光.松材线虫病的病理学研究进展［J］.江西农业大学学报，2003，25(2)：204-208.

［3］杨振德，赵博光，郭建.松材线虫行为学研究进展［J］.南京林业大学学报，2003,27(1):87-92.

［4］罗兰，谢丙炎，杨宇红，等.具杀线虫活性的苏云金杆菌筛选研究［J］.植物病理学报，2007，37(3)：314-316.

［5］彭双，闫淑珍，陈双林.具杀线虫活性植物内生细菌的筛选和活性产物［J］.微生物学报，2011，51(3)：368-376.

［6］程丽云.木霉菌的种类鉴定及生防菌株的筛选［D］.福建：福建农林大学，2007.

［7］万永虎.厚垣孢普可尼亚霉菌ZK7菌株生防制剂的研制及田间使用［D］.云南：云南大学，2013.

［8］李芳.淡紫拟青霉菌生物学特性与次生代谢物质生物效应研究［D］.福建:福建农林大学，2005.

［9］姜培增，李宏园，陈铁保.淡紫拟青霉防治植物线虫研究进展［J］.中国农业科技导报，2006，8(6)：38-41.

第1作者简介：魏博涵（1995-），女，本科生。

The Insecticidal Activities of Ethyl Acetate Efficiently Extracts from Fifteen Bio-control Strains to Pine Wood Nematode

WEI Bohan
（The Northeast Forestry University,HeilongjiangHarbin150040）

Efficient strains for killing pine wood nematode were screened through the research on insecticidal activities of ethyl acetate efficiently extracts from fifteen bio-control strains to pine wood nematode.They arePaecilomyces lilacinusPT1，TrichodermaSPP.T-28，TrichodermaSPP.T-19 and TrichodermaSPP.T-43.Paecilomyces lilacinusPT1 has the best killing effect to the nematode,the death rate reached 100%within ether 24 h,48 h or 72 h，the death rate ofTrichodermaSPP.T-28 reached 78.64%in 24 h，48 h for 97.12%and reached 100%in 72 h;TrichodermaSPP.T-19 andTrichodermaSPP.T-43 death date in 72h was 63.59%，63.17%respectively.These strains can be used as efficient strains for further research.

Bursaphelenchus xylophilus;Paecilomyces lilacinus;Trichoderma;Phchonia chlamydosporia; Killing activities toBursaphelenchus xylophilus

S 763.306.4

A

1001-9499（2017）01-0024-03

宋瑞清（1964-），教授，博士，博士生导师，从事菌物开发利用及林木病害可持续控制。

2016-11-29

（责任编辑：王岳）

*由948项目资助（项目编号：2015-4-34）；东北林业大学本科生创新项目