产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达

张蓉蓉++艾地云++张腾飞++罗青平++温国元++王红琳++汪宏才++邵华斌

摘要：以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因，构建了表达质粒pGEXKG-β1，将构建的KG-β1转化受体菌BL21（DE3），得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。

关键词：产气荚膜梭菌；β1毒素；克隆表达

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）09-0007-02

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中广泛分布，是人和动物肠道内的一种正常菌，能产生a、β、ε、ι四种主要毒素，根据产生这四种毒素种类的不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五种类型[1]。该菌在家禽中主要是能引起坏死性肠炎，鸡源产气荚膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型产气荚膜梭菌主要产生a和β两种毒素。其中β毒素具有细胞毒性和致死性的特点，是重要的致病因子[2]。课题组在前期进行了鸡源产气荚膜梭菌a毒素的克隆表达及免疫原性研究[3]，本研究旨在进一步对β毒素进行克隆表达，为其诊断试剂和亚单位疫苗的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 C型产气荚膜梭菌、受体菌大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamH I和Xho I、PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参照NCBI中产气荚膜梭菌β1毒素全基因组序列，设计1对β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小为1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分别含有BamH I和Xho I酶切位点。

1.2.2 全基因组的提取 将产气荚膜梭菌在厌气肉肝汤中于37 ℃厌氧培养过夜离心后，将沉淀菌细胞重悬于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混匀后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit说明书进行全基因组的提取。

1.2.3 PCR扩增 50 μL PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.4 PCR产物的回收、连接转化及鉴定 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳回收后，以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按说明书操作。将回收纯化的目的产物与pGEX-KG载体双酶切后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含有氨苄西林（Amp）抗性平板进行筛选培养，挑取白色菌落于含Ampr的LB液体培养基上培养过夜，以SDS碱裂解法提取重组质粒，经PCR鉴定及BamH I和Xho I双酶切分析筛选阳性克隆。

1.2.5 阳性质粒的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 将构建的阳性质粒转入受体菌BL21（DE3）经37 ℃加IPTG诱导后，按文献[4]报道的方法收集菌体变性处理后，进行SDS-PAGE电泳分析。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定结果

采用设计的特异性引物进行β1毒素基因的PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，以产气荚膜梭菌为模板扩增出约1 000 bp的特异性条带，与预期大小相符（图1）。

2.2 重组质粒的双酶切鉴定

将质粒经PCR鉴定后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切鉴定，结果见图2。由图2可见，经双酶切后可获得大小约为5 000和1 000 bp的2条DNA条带，即pGEX-KG载体和目的基因条带，初步表明成功构建产气荚膜梭菌β1毒素克隆表达质粒。

2.3 β1毒素基因表达产物SDS-PAGE分析

将BL21（DE3）菌株作为表达的宿主菌，经转化挑取单个菌落培养诱导后，菌体经超声波处理，提取包涵体，上清经80%饱和硫酸铵沉淀后得到浓缩，沉淀经透析后，用SDS-PAGE分析（图3），在相对分子质量约为56 ku处出现特异性蛋白条带，结果表明β1毒素可在宿主菌种得以表达，并且β1毒素蛋白多以包涵体的形式存在表达。

3 讨论

产气荚膜梭菌能产生多种具有致病性的外毒素，其中β毒素不仅能引起家禽坏死性肠炎及仔猪肠毒血症，也能引起婴幼儿的坏死性肠炎[5]，危害极其严重。本研究利用PCR技术，设计特异性引物成功地从C型产气荚膜梭菌中扩增出目的片段β1，并构建了成功表达β1毒素的重组菌株，表达的蛋白以包涵体形式存在，纯度高。β1毒素的表达为产气荚膜梭菌的临床诊断和基因工程疫苗提供了前提。

参考文献：

[1] SPARK S G， CARMAN R J， SARKER M R，et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）：883-888；

[2] TIMBERMONT L， LANEKRIET A， PASMANS F，et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology， 2009（12）：l-4.

[3] 张蓉蓉，艾地云，张腾飞，等. 鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究[J].湖北农业科学，2015，54（20）：5152-5154.

[4] 梁宋平.生物化学与分子生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2003.

[5] GRANUM P E. Clostridium perfringens toxin involved in food poisoning[J]. Int J Food Microbiol，1990，10：101-111.