大豆响应高温胁迫的生理和分子遗传机理研究现状与展望

李佳佳，郑双雨，孙根楼，张文明，王晓波，邱丽娟



大豆响应高温胁迫的生理和分子遗传机理研究现状与展望

李佳佳1，郑双雨1，孙根楼1，张文明1，王晓波1，邱丽娟2

（1安徽农业大学农学院，合肥230036，2中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物基因资源与遗传改良重大科学工程/农业部作物基因资源与 种质创制重点实验室，北京100081）

大豆是重要的经济作物，是植物油脂和蛋白质的重要来源。近年来，因全球气候变化引起的高温胁迫频发，危及到大豆生长的各个时期，成为制约大豆产量和品质的重要因素之一。为了揭示大豆耐高温性的遗传机理，建立综合高效大豆耐高温评价体系，促进大豆耐高温特性的遗传改良，现对大豆响应高温胁迫的生理生化基础和分子调控机制进行综述。相较于适温条件，高温胁迫可使大豆植株发生叶片增厚、气孔导度下降、细胞膜透性增加、细胞微观组织结构受损以及渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白）含量变化和抗氧化防御系统关键酶活性丧失等生理异常反应，导致植株光合、蒸腾和呼吸作用及物质含量等一系列生理生化过程紊乱。高温胁迫还造成大豆花粉形态异常，绒毡层细胞结构松散、空泡化和自溶化，花粉活力及其萌发率明显下降，花粉败育率增高，致使大豆结荚率和结实率显著降低，进而影响大豆籽粒的正常发育、蛋白的积累和产量形成等，最终导致减产；高温胁迫对大豆籽粒外观品质性状也能造成一定损伤，进而对其经济价值带来不利影响。高温胁迫从转录、翻译和代谢水平影响大豆正常的生理代谢调控。目前，已通过高通量测序等方法鉴定出多个与大豆高温胁迫响应相关的转录因子、蛋白及代谢产物，但与水稻、拟南芥的研究相比仍存在较大差距；初步建立了以花粉活力和多项生理指标为基础的大豆耐高温鉴定方法，但在生产上尚缺乏系统高效耐高温评价体系，耐高温大豆育种工作进展缓慢。国内在大豆耐高温预防措施、耐高温综合评鉴体系建立、优异耐高温大豆种质资源筛选及耐高温关键功能基因挖掘等方面仍然存在挑战。为应对极端生态环境给大豆生产造成的不利影响，未来应通过建立综合高效大豆耐高温评价技术体系，提高大豆优异种质资源鉴定水平，重点解析大豆耐高温的分子遗传机理、挖掘耐高温关键基因，结合常规育种和分子育种技术培育综合性状优异的耐高温大豆新品种，以实现大豆品种耐高温性与高产、优质的统一。

大豆；高温胁迫；耐热性；生理生化特性；分子机理

0 引言

温度是控制植物生长和发育的关键因素[1]。全球气候变化情况表明，2100年全球平均气温预计将会比1980—2000年的平均气温增加1.8—4.0℃或更高[2]，其中，夜温的增幅将远大于日温的增幅[3]。高温（high temperature，HT）将是未来气候的重要特点之一[4]。HT胁迫能够显著影响植物的正常生长发育，造成细胞膜完整性损伤，叶片或花器官组织畸变，花粉活力及萌发率下降、花粉败育，结荚率降低、种子组分构成异常及数量下降，最终导致作物产量和品质均显著下降[4-15]。由HT环境引起植物的生理性伤害称为HT伤害（胁迫），HT胁迫已经对全球作物的生产构成了严重威胁[16-17]。

大豆是重要的经济作物，富含油分和蛋白质，能够为人类和动物提供重要的食用油和高蛋白饲料资源[18-19]。大豆最适生长温度在发芽和成熟期为15—22℃、开花期为20—25℃，当环境温度高于28°C时能够影响大豆正常的发育进程[12,20]。相较于营养生长阶段，生殖生长时期（R1—R7）对HT胁迫更加敏感，当环境温度达到33—40℃时将严重减缓大豆植株的生长进程并造成发育异常[21]。温度变化已经在很大程度上影响了大豆的分布、生长、产量和品质等[19-20]。HT胁迫能够增加大豆叶片厚度、降低气孔开度、增加细胞膜透性、扰乱细胞微观组织结构，进而导致花粉形态和绒毡层细胞异常[4,14,22]。HT对大豆植株的光合作用和蒸腾作用能够产生直接的强烈胁迫危害[16]，造成大豆植株光合速率显著下降[4,12]、蒸腾作用明显加剧[17,23-25]以及呼吸速率异常[15,26]等，植株体内物质含量和抗氧化保护酶系统也发生显著性变化[14-15,22-23,27]。HT胁迫还能显著降低大豆植株花粉活力及其萌发率，增加花粉败育率，进一步影响大豆籽粒发育和产量形成，最终可能造成减产，甚至绝收[12,14-15,18]。研究发现，在18/12℃和26/20℃（昼/夜）之间大豆种子产量会随着温度的增加而增加，当温度高于26/20℃时其产量将会下降[28-29]。进一步研究表明，温度每增加1℃就会导致大豆产量下降16%—17%[30-31]。HT胁迫不仅对大豆的生理生化产生危害，还能通过转录、翻译和代谢水平对大豆的正常生长发育产生广泛影响[26,32-39]。

高温对大豆的生长发育造成了显著的不利影响，个别年份对中国黄淮海流域大豆安全生产构成了一定威胁，但目前中国在大豆耐HT生理生化基础和分子遗传机理方面的研究进展仍十分薄弱。因此，研究大豆耐HT生理生化机制、明确耐高温防御策略、完善大豆耐HT综合评鉴体系、筛选耐HT大豆新种质及培育耐高温大豆新品种将是未来基础研究和育种家的工作重点和共同努力方向。同时，随着高通量基因鉴定方法、基因编辑技术和大豆转基因技术的成熟，为大豆耐HT候选基因/蛋白功能的验证、耐HT分子生物学基础和分子遗传机理的解析创造了条件。鉴于此，本文就近年来国内外对HT胁迫在大豆生理生化上的影响和耐HT性分子遗传机理探索等方面的研究进展进行梳理和总结，提出了当前形势下大豆耐HT生产发展面临的挑战和机遇，旨在为实现大豆耐HT生产与高产、优质的统一提供理论基础和技术支撑。

1 高温胁迫对大豆主要生理生化代谢的影响

1.1 高温胁迫影响大豆细胞组织结构和膜稳定性

细胞膜是防止胞外物质自由进入细胞的屏障，既能维持细胞内稳定的代谢环境，又能调节和选择物质进出细胞[40]。HT胁迫下，细胞原生质膜的结构和功能会首先受到伤害，造成膜透性增加、细胞内电解质外渗，导致组织浸出液的相对电导率增大[23,41-42]。叶片是植物感受HT胁迫最直接的组织器官，HT胁迫下，大豆叶片中细胞质膜、叶绿体膜和类囊体膜的完整性均出现不同程度的损伤，其中，类囊体膜对HT胁迫更为敏感[4]。此外，HT胁迫还导致大豆叶片细胞中的线粒体膜、线粒体嵴、基质及线粒体边缘均被完全扭曲，同时，细胞的线粒体和叶绿体的大小及数量均表现出缩减的趋势[4]。HT胁迫能够显著增加大豆叶片中栅栏组织、海绵层和下表皮的厚度，导致植株叶片增厚，同时，还能明显降低叶片的气孔开度[4]。HT高湿胁迫处理后，大豆种皮细胞明显变疏松、种皮内空隙增多，柱状细胞、海绵组织和种皮横切面厚度均显著增厚，尤其是海绵组织增厚程度最明显[22]。HT胁迫下的大豆花粉粒细胞外壁变得较厚，绒毡层出现空泡化且具有自溶性，生殖细胞呈梭形、染色质呈凝聚状态等[14]，花粉粒的解剖结构表现出明显的异常形态。HT胁迫加剧了植物细胞膜脂过氧化损伤可能是造成质膜透性增大和电解质渗漏的重要原因。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生能够加剧细胞膜的损伤[43]。MDA含量越高，表明植物的膜脂过氧化作用越强，植物细胞膜受到的损伤就越严重。韩永华等[23]研究发现HT/渗透胁迫会导致大豆叶片中的MDA水平显著升高，对细胞膜形成伤害。不同参试大豆材料的MDA含量受HT影响增幅不同，增加幅度在15%—64%[27]。HT胁迫下，大豆幼苗叶片中MDA的积累会随温度升高和胁迫时间的延长而迅速增加，结果表明，大豆的膜脂过氧化程度与HT胁迫关系密切[24]。此外，MDA含量的增长不仅取决于绝对温度，还与胁迫时间的长短相关[44]。MDA水平在一定程度上反映了细胞膜脂的过氧化损伤程度，可作为评价大豆HT胁迫损伤的生理指标。

1.2 高温胁迫对大豆光合、蒸腾和呼吸作用的影响

光合作用是植株产量形成的基础，也是植物对HT胁迫最敏感的生理过程之一[16]。沈证言等[45]研究发现，HT胁迫后，菜豆叶片的光合作用普遍受到抑制，受抑程度因品种的耐热性而异。随着温度升高和胁迫时间的延长，大豆叶片中叶绿素含量逐渐下降，且温度越高下降越快；胁迫时间越长，叶绿素含量越低，叶绿素合成速率下降、叶绿体结构与功能受损，进而导致光合作用异常[24]。在对大豆耐热材料K03-2897的研究发现，HT胁迫同时显著降低了叶片的叶绿素含量、光系统Ⅱ量子效率（FPSⅡ）以及光合速率[4]，导致大豆植株光合速率和气孔导度分别下降了20.2%和12.8%[4,13,15]。在HT和干旱双重胁迫条件下，大豆植株气孔导度降幅最大可达93%，净光合速率均呈下降趋势[27]。此外，相较于适温条件（28/18℃），HT胁迫（38/28℃）使大豆叶片的光化学效率和光合速率分别显著下降了5.8%和12.7%[12]。有意思的是，HT胁迫下植株在很短的时间内其光合作用就会受到抑制，但随着HT时间的延长，植株会逐渐适应HT下的生存环境，其光合速率也会随之提高[46]。因此，在HT胁迫下，能够维持较高光合同化能力的大豆品种可初步判定其具有耐热潜力。

植物的蒸腾作用会随着温度的增加而增强，可以起到降温的作用，防止叶片被HT灼伤[47]。HT胁迫下，叶片蒸腾强度的变化主要体现在植株体内的含水量上，因此，相对含水量是植物蒸腾作用的直观表现[24]。HT胁迫下，大豆叶片相对含水量明显降低，随着温度升高和胁迫时间的延长，蒸腾作用加剧，大豆体内水分的亏缺越来越严重[23-24]。温度每增加3℃或以上将导致大豆植株蒸腾速率上升和冠层导度下降，并进一步影响籽粒大小造成大豆产量下降[25]。因此，HT能够直接导致大豆植株蒸腾作用异常从而进一步影响其生长发育[17]。

一般情况下，温度升高往往会使植物出现呼吸速率加快，但当温度升高到一定范围时，呼吸速率反而下降，这在其他物种上已得到证实[48-50]。DJANAGUIRAMAN等[15]研究发现，HT胁迫处理10 d后，大豆叶片呼吸速率明显增强，同时需要消耗相应同化物（碳水化合物）才能维持植物正常的呼吸作用需求。HT胁迫能够使植株呼吸作用产生过激行为，这对大豆植株同化物的积累是极为不利的[26]。HT对于植株呼吸作用的影响比较复杂，涉及到一系列的酶促反应和物质代谢等，其响应HT胁迫的变化规律仍需进一步探索。

1.3 高温胁迫影响大豆渗透调节物质代谢和保护酶系统的平衡

植物在逆境胁迫下，会形成脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质等一些渗透调节物质，从而保持植物细胞水势的平衡[51]。研究表明，脯氨酸可以抑制细胞膜透性的增大和MDA含量的增加[47]，同时，脯氨酸含量的大幅增加也有利于植物组织对水分的保持，从而减缓由HT胁迫引起的蒸腾作用加剧对植株产生的伤害[46]。随着环境温度的升高和胁迫时间的延长，大豆植株叶片相对含水量下降，质膜透性增大，就会降低脯氨酸合成酶类对脯氨酸反馈抑制的敏感性，进而导致大豆体内游离脯氨酸含量急剧增加[24]。过表达的大豆植株在HT胁迫期间的脯氨酸含量也呈现出增长趋势，最高增幅可达50.0%，结果表明，渗透调节物质含量的增加可以在一定程度上增强过表达转基因株系的耐热性[27]。

可溶性糖对植物细胞具有渗透调节及保护细胞膜结构稳定的作用[52]。对生理成熟期的大豆品种进行HT高湿胁迫处理，发现随胁迫时间的延长大豆种子中可溶性糖含量呈上升趋势[22]。HT胁迫还能使大豆叶片中可溶性糖水平随温度的升高而呈现明显的增加趋势，增幅为61.5%—91.0%[27]。此外，在HT胁迫下，大豆叶片中的还原糖和总可溶性碳水化合物含量增加，而蔗糖含量下降，蔗糖含量的下降可能是由于光合作用减弱导致植株体内碳水化合物合成下降所致[13]。由此可知，大豆体内可溶性糖含量的积累可能是其提高抗热性的一种潜在机能，以减缓HT对植株不同组织部位的伤害程度。研究表明，可溶性蛋白具有渗透调节和防止细胞脱水的功能[53]。HT胁迫虽然能够使大豆叶片中可溶性蛋白含量增加[13]，但其与HT胁迫的具体关系尚未明了，仍需进一步探索。

植物体内抗氧化酶促防御系统包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等，它们的主要功能是清除植物体内产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧阴离子自由基，减轻膜脂过氧化程度，因而成为植物抗热性生理基础研究之一[54]。HT/渗透胁迫下，吉林27号和白农6号2个品种的SOD酶活性均升高，一定程度的胁迫处理可能激活了SOD酶活性，严重（或持续性）的胁迫将会抑制其活性。在胁迫处理下，白农6号中的CAT酶活性升高，变化趋势与SOD酶活性相似；而吉林27号中CAT酶活性则呈现下降趋势，因此，作者推测白农6号大豆品种抗HT的能力大于吉林27号[23]。DJANAGUIRAMAN等[12]研究发现，HT胁迫导致大豆叶片中SOD、CAT和POD等酶活性分别下降13.3%、42.9%和44.6%，造成这些抗氧化酶活性丧失的主要原因可能是由于HT胁迫下ROS的大量产生所致。进一步分析发现，HT胁迫下叶片中超氧阴离子自由基、过氧化氢含量以及细胞膜损伤程度在HT胁迫下分别提升了63.0%、70.4%和54.7%，这个结果验证了上述的推测。随后的研究再次表明，HT胁迫导致大豆叶片中ROS增加，抗氧化酶活性降低，造成氧化性损伤，最终可能会造成叶片过早衰老[13]。此外，大豆幼苗叶片中SOD活性在HT胁迫初期呈明显增加趋势，说明在HT胁迫初期，大豆幼苗可以通过增加SOD活性来提高其耐热性；但随着胁迫时间的延长，SOD活性呈现出下降趋势，大豆幼苗受害明显加重[24]。

综上所述，SOD、POD、CAT和APX等植物抗氧化酶促防御系统中的酶活性对植物的生长发育至关重要。HT胁迫导致这些酶活性丧失或下降，将会造成植物体内ROS或自由基水平上升，对植物组织细胞造成伤害，甚至死亡。

1.4 高温胁迫影响大豆花粉活力、产量和品质形成

花粉活力及萌发率的高低直接关乎到豆科作物最终的有效结实率和籽粒产量。植物生长发育期间，当水分不是限制因子外，温度对于花粉粒、花粉管生长和座果率等生殖过程的影响较之其他因素均比较明显[19]。在花粉发育、萌发和花粉管生长期间，环境胁迫的加剧（尤其是HT）将会影响花粉的功能和最终的结实率[19]。无论是单一的HT胁迫或HT与CO2及UV-B辐射的组合胁迫均能造成大豆植株基序花瓣和雄蕊柱长度变短、花朵变小，进而导致花粉粒发育异常、花粉管长度缩短且花粉萌发率降低[55]。HT胁迫不仅造成大豆植株花粉发育异常、气孔和柱头发育明显减缓等[18]，还导致大豆花粉细胞畸变、外壁增厚且绒毡层解体，进而使大豆体外花粉萌发率显著下降了22.7%[14]。进一步研究发现，高日温或夜温胁迫均能造成大豆花粉活力、花粉萌发及结荚率显著下降，并最终导致籽粒产量下降[15]。此外，花粉粒中饱和磷脂与磷脂酸类物质水平在HT胁迫下的减弱也可能是花粉萌发率降低的一个原因。另外，大豆花粉的萌发率降低或败育或许还与HT胁迫导致绒毡层的过早衰退有关[56]。综上所述，HT胁迫导致花粉萌发及其活力的丧失可能是豆类作物籽粒产量下降的主要原因[57-59]。鉴于此，可以将花粉活力及其萌发率的高低作为一个重要生理指标应用到大豆品种资源的筛选和耐热型评价体系中。

HT胁迫影响大豆生理生化的最终结果会体现到其产量上。THOMAS等[60]研究发现一个受生长素调控的基因（）在HT胁迫下显著下调表达，说明HT胁迫可能导致大豆种子发育进程发生了变化。另外，一个在大豆种子正常发育期间表达的β-葡萄糖苷酶基因，在28/18℃生长条件下的大豆种子中能够检测到，但在40/30℃生长条件下的大豆种子中未检测到，说明大豆种子组分发育的正常进程可能被HT胁迫打乱。HT胁迫下，大豆种子萌发率和活力均显著下降，种子畸变的比率明显提升[61]。从出苗到开花期，温度增高可使大豆植株的百粒重增加，但从出苗期到鼓粒期，持续的HT胁迫能够导致大豆单株产量显著下降[62]。在开花和结荚期间，HT胁迫能够造成大豆植株种子形成率下降，并减缓种子的生长；从开花期到成熟期，每天白天35℃HT胁迫处理10 h，可造成最大减产量约为27.0%；但高夜温处理后，在任何生殖生长阶段均未发现有明显的产量丢失，因此，大豆产量的下降可能主要归咎于白天的HT胁迫所致[29]。DJANAGUIRAMAN等[12,14]研究表明，在HT胁迫下，大豆结荚率、结实率、种子大小和每株种子产量分别下降了35.2%、18.6%、64.5%和71.4%，推测其原因可能是由于HT胁迫造成大豆花粉解剖结构变化导致花粉萌发率下降所致。该团队随后的报道再次表明了相似的结果[15]。相较于低温胁迫（22/18℃），大豆的生物量和籽粒产量在HT胁迫（36/32℃）下的降幅比例要大很多[63]。此外，HT胁迫时间的长短与大豆种子组分异常也有一定关系，长时间的HT胁迫能够造成大豆种子产量组分产生更大的负向效应，种子产量组分会随着温度的升高而呈线性下降[17]。

HT胁迫下大豆品质性状的变化可能会直接影响到大豆的经济价值。大豆种子在HT（33℃）胁迫下展现出油分含量下降、蛋白质浓度增加的结果表明，HT胁迫对种子填充和成熟期阶段的油分、蛋白质和脂肪酸组分的影响较大[64]。随着温度的升高，大豆含油量和油分碘值普遍下降，而蛋白质含量则普遍增加，这对大豆种子中蛋白质的积累可能是有利的[65]。多数人的观点是，当温度升高到31℃时，种子总油分含量就开始下降[66-68]，也有人认为，大豆种子总油分含量在32℃[60]或33℃[69]时达到最大值，之后随温度的升高而下降。而大豆种子蛋白含量在HT胁迫下则表现出上升趋势[66,69]，特别是种子发育晚期，温度对蛋白质含量的影响极为显著[66]。因此，宋晓昆等[70]认为蛋白含量高、脂肪含量低的品种较耐HT，高蛋白材料可以作为耐HT型大豆筛选的潜在对象。

2 大豆响应高温胁迫的分子遗传机理

2.1 大豆耐高温相关基因的挖掘和解析

解析耐HT相关基因功能及其参与的代谢调控网络，对阐明作物耐HT分子遗传机制，推动耐HT遗传育种和生产发展具有重要意义。当前，很多作物耐热基因已经被鉴定，其中大多数是数量性状位点（quantitative trait loci，QTL），例如水稻中的和[71]，、和等[72]。此外，转录因子基因在植物的HT胁迫信号转导以及耐HT响应过程中也能发挥重要作用[32,73-78]，其中大多数属于热激转录因子（Hsf（heat stress transcription factor）和Hsp（heat shock protein））基因。

转录因子DREB2A不仅能够调控植物响应干旱和盐害等胁迫，还能在HT胁迫下诱导拟南芥植物体中HsfA3的表达从而提高其耐热性[73-74]。将水稻中一个A2型Hsf基因过表达导入拟南芥，结果发现，转基因拟南芥中一些胁迫相关基因（尤其是Hsp类）能够被诱导高度表达，同时，在其营养生长、花茎伸长和种子发育阶段均表现出较强的抗HT性[75]。此外，诸如[76]、（与DREB2A互作）[77]和[78]等转录因子基因在植物耐HT胁迫响应中也能发挥重要功能。模式植物中这些耐HT性相关基因的挖掘和功能解析，不仅为阐明作物耐HT分子遗传机理提供了重要的理论基础，同时，也为大豆耐HT关键基因的挖掘和功能分析指明了方向。过表达转化大豆，不仅能够激活转基因大豆植株体内热激蛋白基因的转录，还增强了另外2个基因和的表达，显著提高了转基因大豆植株的耐HT能力（52℃）[27,32]。LI等[33]利用在线工具鉴定并分析了38个大豆Hsfs家族基因的遗传结构和蛋白功能域，并验证的过表达改善了拟南芥植物对干旱和HT胁迫的忍耐性。大豆HSP70基因家族的全基因组表达谱分析结果表明，HSP70家族基因不仅参与大豆组织器官的发育，还对HT和干旱胁迫产生应激响应，从而保护大豆植株抵抗非生物胁迫的危害[34]。此外，大豆中受赤霉素诱导的MYB类转录因子结合蛋白1（）基因过表达转化烟草的结果发现，相对于WT材料（叶片失绿变黄、萎蔫坏死），48℃下HT胁迫的转基因烟草叶片并未明显变黄；55℃HT胁迫后，转基因烟草幼苗存活率为24.14%，仍高于WT。结果表明，过表达大豆能在一定程度上提高转基因烟草幼苗的耐HT性[35]。

2.2 大豆耐高温性分子遗传机理

近年来，高通量测序技术、基因工程等新兴分子生物学技术的发展与成熟，为探索作物耐逆性分子机理提供了有利工具，并为耐逆性相关基因的挖掘提供了便利条件。研究发现，HT胁迫在转录、翻译和代谢等多个方面对作物的生长发育产生了广泛影响，目前已鉴定出多个作物响应HT胁迫的相关基因、蛋白质、代谢物和相关代谢通路。拟南芥耐HT性的增强可能与热激蛋白诱导表达、激素调控（如脱落酸（abscisic acid，ABA）和水杨酸（salicylic acid，SA））、ROS以及UVH6等代谢途径有关[79]。而参与糖酵解和三羧酸循环、氨基酸代谢、淀粉和蔗糖代谢等碳水化合物合成途径的蛋白（如甘油醛3-磷酸脱氢酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉和酶等）以及许多氧化还原平衡蛋白（如抗坏血酸氧化酶和过氧化物酶等）表达丰度的变化可能对水稻谷粒乳熟期、蜡熟期和成熟期耐HT性的提升具有重要作用[80]。随着分子生物学技术的发展，有关大豆耐HT性分子遗传机制的研究也被相继报道。VALDÉS-LÓPEZ等[36]对HT胁迫下的大豆根毛进行了转录组和蛋白质组比较分析，共鉴定出10个关键基因调控模块能够响应HT胁迫，另外还发现多种蛋白的表达丰度在HT胁迫下发生变化，结果表明，HT胁迫处理6h后，大豆根毛中的大部分差异基因/蛋白都能直接参与到HT胁迫响应中。利用传统2D-DIGE（two-dimensional differential gel electrophoresis）技术对HT、干旱以及HT与干旱互作胁迫下的2个大豆品种叶片进行蛋白质组比较分析，结果发现，44个非生物胁迫响应蛋白表现出差异性，表明多种信号串联和分子过程可能受到了HT和干旱胁迫的影响。进一步分析发现，EF-Tu蛋白和HSPs相关蛋白在HT胁迫下的上调或高丰度表达可能是大豆耐HT机制增强的主要原因之一[37]。此外，相较于适温（28/24℃）和低温（22/18℃）处理，在HT（36/32℃）胁迫下共检测到35个大豆种子组分代谢物表现出差异性，其中天冬酰胺、组氨酸、缬氨酸、莽草酸和油酸等代谢物水平在HT胁迫下显著升高，结果表明HT胁迫已经对大豆种子组分及其代谢物水平产生了严重影响[38]。而耐热型和热敏感型大豆种子代谢组表达谱分析结果进一步发现，多种抗氧化代谢物，包括生育酚、黄酮类、苯丙素类和抗坏血酸前体等在耐HT基因型大豆种子中高度富集，也可能是大豆种子耐HT性的主要原因之一[39]。上述研究已经从不同方面或以不同技术对大豆不同组织部位响应HT胁迫的相关分子机制进行了探索分析，但鉴于作物对HT胁迫的响应机制比较复杂，不同的品种、组织部位和发育时期等对HT胁迫的响应机制也不尽相同，因此，为了全面了解大豆耐热性遗传机理，仍需对大豆耐热性相关分子机制做深入的探索研究。

3 展望

3.1 完善高温胁迫下大豆田间综合防控措施

研究发现，在大豆遭受HT胁迫期间，叶面喷施乙烯感知抑制剂——1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）能够显著提高大豆植株的结实率和种子大小，并进一步提高其最终产量[12]。其原理是1-MCP可以通过增强植株体内的抗氧化防御系统降低乙烯产出率并延迟叶片的过早衰老，从而保证了植株的正常发育。进一步研究证实，叶面喷施1-MCP对大豆抵抗HT胁迫具有较好的防御效果[13]。外源喷施2,4-表油菜素内酯（2,4-epi-brassinosteroid，EBR）通过改善大豆植株光合作用也能提高其耐HT性，同时，还能缓解由HT胁迫造成的大豆品质劣变和低产等[81]。此外，SA、ABA和6-BA等分别在葡萄[82]、水稻[83]和番茄[84]上的叶面喷施以及外源性抗氧化防御和解毒物质谷胱甘肽在绿豆上的施用[85]等均已表明，植物生长调节剂或抗氧化防御物质能够提高作物对HT胁迫的抵抗作用，这对大豆抗HT生产或许是一条有效的防御措施。

农作物在长期的进化和驯化过程中能够形成一种适应新环境的独特优点。因此，适当时间和强度的HT处理锻炼，能够激发植物体内的防御系统并产生适应HT环境下的生长机制。顾和平等[86]研究发现，通过连续十年的HT季节种植大豆，其耐热性（37/30℃）有了明显改善，产量也显著提高，这种改善是一种逐步且缓慢的过程。其原因可能是大豆在开花结荚期遇HT天气导致植株体内部分耐热基因被激活，这种激活是不可逆的，一旦被激活将会在后代中稳定遗传，并逐步增强大豆的耐HT能力。这种通过HT锻炼来增强作物耐HT的能力在豌豆[87]和玉米[88]等作物上也已经得到了证实和应用。因此，抗HT锻炼对大豆来说也可能是一种提高其耐HT性的潜在方法。此外，在大豆的生产栽培过程中, 还可以采用平衡施肥、合理密植、及时灌溉等田间管理配套措施，调节田间小气候，实施健身栽培，提高大豆的抗HT性。同时，在探索并掌握大豆耐HT性遗传规律的基础上，也可以因地制宜，采取有效措施，避免或降低HT胁迫对大豆生产带来的影响。

3.2 建立高效大豆耐高温综合评鉴体系

正如前文所述，花粉活力对于大豆的有效结实及其最终产量形成至关重要，相关研究指出花粉活力可以作为鉴定大豆耐HT胁迫的一个重要生理指标加以考察[15,18]。以花粉活力综合响应指标（花朵和花粉形态、花粉产量、萌发率和花粉管长度等在不同胁迫（CO2、HT和UV-B辐射）下的变异性）作为各基因型总的胁迫响应指标（total stress response index，TSRI），将6种基因型大豆划分为胁迫忍耐型（DG5630RR和D88-5320）、中间型（D90-9216和PI 471938）和敏感型（Stalwart III和DP4933RR）[55]，其中耐HT型大豆对HT胁迫不敏感，而中间型和敏感型大豆均表现出花粉变形、花粉萌发率下降、气孔及柱头减少等现象。基于此，SALEM等[18]对44种基因型大豆进行耐HT性分型，通过计算不同基因型品种的最大花粉萌发率、花粉管长度以及最高温度、最适温度和最低温度分别对不同基因型品种花粉萌发率和花粉管长度的温度效应值，然后将这8个独立胁迫响应指标的总和作为每种基因型大豆总的温度累积响应指标（cumulative temperature response index，CTRI，无量纲）。根据CTRI值，将13种基因型大豆品种归为耐HT型、22种划为HT中间型、9种为HT敏感型。综上所述，以花粉活力等综合响应指标的鉴别体系对筛选和评鉴耐HT性大豆品种或许是一条有效的方法。

此外，以营养和生理参数等综合响应指标为基础的评价体系对筛选和评鉴耐HT型大豆品种也可能是一种重要途径。KOTI等[89]以营养和生理参数响应胁迫指标为标准对上述6种基因型大豆耐胁迫性再次评鉴分型。基于该综合指标，6种基因型大豆被分为胁迫忍耐型（PI471938和D88-5320）、中间型（D90-9216和DG5630RR）以及敏感型（StalwartⅢ和DP4933RR），与利用花粉活力作为评价标准得出的结果存在一定差异[55]。靳路真等[90]通过主成分分析将13个大豆的一级生理指标（百粒重、单株粒重等）转化为6个综合性指标，获得耐热性综合评价值，然后基于该综合值将国内外155份大豆种质划分成6种类型，即强耐热型Ⅰ、耐热型Ⅱ、中度耐热型Ⅲ、中度敏感型Ⅳ、敏感型Ⅴ和极敏感型Ⅵ；并根据综合值鉴定出4个耐热型品种和63个热敏感型品种。最终筛选出7个开花期耐热性鉴定指标（百粒重、单株荚重、每荚粒数、茎粗、主茎节数、节间长度和蛋白质含量）和7个鼓粒期耐热性鉴定指标（单株粒重、单株荚重、每荚粒数、单株荚数、地上部干物重、株高和节间长度），2个时期的耐热性鉴定指标包含了产量性状和形态性状，但并不完全一致。

尽管有些作物在抗HT鉴定上已经得到成功应用，但仍缺乏普遍性，目前尚无统一的标准评鉴体系。当前，在大豆耐HT评鉴过程中，哪个发育期最具代表性、是以自然环境下的HT还是在此基础上浮动1—5℃进行胁迫处理等均未达成统一认识，这使得大豆耐HT研究的范围更加宽泛，也为大豆耐HT研究提出了一定挑战。此外，仅用单一的产量、形态或品质等生理生化指标不能完全准确评判大豆的耐HT性等级，需补充相应的参数指标和当地气候变化规律等。小麦[91]和茄子[92]等作物的耐HT性田间或温室直接鉴定法结合其生理指标等间接鉴定法或许可以为大豆品种耐HT性鉴定提供一定的经验。另外，以花粉活力及其萌发率为基础，结合其他生理生化指标形成一种响应HT胁迫的综合性指标对耐HT型大豆品种的鉴定可能也是一种有效方法。因此，探索和建立一种综合性、科学化和系统性的大豆耐HT性等级标准及筛选和评鉴体系方法是非常必要的，对大豆育种和生产发展也具有一定的理论意义。

3.3 发掘和培育耐高温大豆新种质

从根本上解决大豆抗HT生产，还需要在挖掘和培育耐HT型大豆新品种方面下功夫。常规的大豆耐HT育种方法有杂交育种、诱变育种和突变体育种等。相比之下，转基因育种可能也是一条有效途径。陈晓军等[32]的研究已经表明，过表达转基因大豆株系能够显著提高转基因大豆材料的耐热性（52℃），同时，转大豆材料的获得也将有助于大豆耐热性分子机制的研究。此外，相较于早熟品种，晚熟品种大豆全生育期阶段的植株叶面积、豆荚和粒数及产量水平在HT胁迫下是增加的，结果表明，晚熟品种在HT胁迫下可以通过改良产量源（叶面积和叶片光合作用）和增加库容量（花朵、豆荚及籽粒的数量）来保持或提高其产量[93]。该结果为选育耐热型大豆品种（晚熟）提供了育种方向。

转基因育种对大豆耐热型新品种培育是一条有效途径，且随着大豆转基因技术体系的日益成熟，未来有望在这个方面取得突破性进展。目前国内的大豆转基因体系和转基因作物推广等方面仍然存在诸多问题，给转基因耐高温大豆新品种培育带来一定挑战。中国大豆种质资源丰富，尤其是野生大豆在抗逆性和适应性方面要优于栽培大豆，因此，挖掘野生大豆中的优异耐热基因资源用于丰富大豆的遗传基础，对提升大豆抗HT胁迫能力以及培育耐HT大豆新品种具有重要意义。

4 展望

HT胁迫已经严重威胁到了作物的分布、生长、产量和品质，甚至生存。大豆是重要的经济作物，对HT胁迫比较敏感，在中国高蛋白大豆主产区的黄淮海流域，HT胁迫目前已演变成一种主要的非生物逆境，对当地大豆生产安全构成了极大威胁。因此，全面了解HT胁迫对大豆生理损伤的遗传机理，建立高效大豆耐HT综合评价体系，发掘大豆耐HT型种质资源，利用新兴分子生物学技术全面解析大豆耐HT性分子遗传机制、鉴定相关候选基因和代谢产物，阐明大豆耐HT分子代谢调控机理，实现大豆品种耐HT性与高产优质的统一，将成为丰富未来大豆育中基础理论和应用研究的重要方向。

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（责任编辑 李莉）

Advances and Perspectives in Research of Physiological and Molecular Mechanism of Soybean Response to High Temperature Stress

LI JiaJia1, ZHENG ShuangYu1, SUN GenLou1, ZHANG WenMing1, WANG XiaoBo1, QIU LiJuan2

(1College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI)/Key Laboratory of Crop Gene Resource and Germplasm Enhancement (MOA), Beijing 100081)

Soybean is a key economic crop, and is an important source of plant protein and oil. In recent years, high temperature (HT) stress caused by global climate change has threatened the key growth period of soybean, and has become one of the main environmental factors which limited the yield and quality of soybean. In order to reveal the molecular mechanism, establish a comprehensive efficiency evaluation system and promoting genetic improvement of soybean resistance to HT stress, the physiological and biochemical basis and molecular regulation mechanism responding to HT stress of soybean were reviewed in this paper. Compared to optimum temperature, the thickness of leaves increased, the stomatal conductance decreased, the membrane permeability increased,cell microstructure and its integrity damaged, the osmoregulation substances (proline, soluble sugar and protein) changed and the key enzyme activities of the antioxidant defense system in soybean have been lost under HT stress, these results will lead to disorders of a series of physiological processes in soybean, which include the photosynthesis, transpiration, respiration and substance content, etc. Besides, HT stress also caused the abnormalities of pollen morphology, the tapetum cytoplasm is not dense, showing vacuolated and autolysis, the pollen vigour and germination rate are significantly decreased, and pollen abortion rate increased, thus resulting in the pod-set rate and seed-set percentage remarkable decrease, and affecting the normal development and protein accumulation of seed and yield formation of soybean, and ultimately leading to lower yields of soybean. Meanwhile, HT stress can also cause some damage to quality traits of seed, and then has an adverse effect on its economic value of soybean. Moreover, normal physiological metabolism is widely affected by HT stress at the level of transcription, translation and metabolism. At present, many transcription factors, proteins and metabolites response to HT stress in soybean have been identified by the method of high-throughput sequencing, however, there is still a wide gap compared with research on rice and. Currently, the comprehensive stress response indexes based on pollen viability andseveral physiological parameters have been used to screen HT resistance soybean varieties, but, the method of system identification is still imperfect in soybean production, and thus leading to the slow progress in selection of HT resistant soybean. Up to date, challenges are still existed in preventive measures, the establishment of a comprehensive evaluation system, screening for excellent soybean germplasm related to resistance to HT, and identification of key functional genes resistance to HT stress in soybean. The adverse effects of extreme ecological environment on soybean production will be further aggravated with the uncertainty of global climate change. In the future, the main focuses should be put on the establishment of a comprehensive evaluation technology system, improvement of the identification level of soybean germplasm resources, elucidation of molecular genetic mechanism and excavation ofkey genes resistance to HT in soybean. Selecting new soybean varieties with resistance to HT stress by both of the conventional breeding and molecular breeding technologies, thus will provide a theoretical basis and technical support for achieving the unification of HT resistance as well as high yield and quality in soybean.

soybean; high temperature stress; heat tolerance; physiological and biochemical characteristics; molecular mechanism

2016-12-26；接受日期：2017-04-12

国家重点研发计划（2016YFD0100201）、安徽省教育厅自然科学重点项目（KJ2016A843）、安徽省引进高校领军人才团队项目

李佳佳，E-mail：lijia6862@163.com。通信作者王晓波，E-mail：wxbphd@163.com。通信作者邱丽娟，E-mail：qiulijuan@caas.cn