氨基化修饰介孔二氧化硅用于疏水性药物的负载和释放

2017-02-03 03:28颜建民张裕卿
化学工业与工程 2017年3期
关键词:介孔二氧化硅恒温

颜建民,张裕卿

(天津大学化工学院,天津 300072)

近些年来,癌症已经成为威胁人类健康的主要疾病之一[1]。在癌症治疗中采用的化学药物毒性很大且没有选择性,整个治疗过程中体内正常细胞也会受到很大的伤害,如何降低药物的细胞毒性成为了当今癌症治疗领域的研究热点。

1992年,Mobil公司成功制备出M41S有序介孔二氧化硅(MSN)材料[2]。2001年,Vallet等[3]第 1次将MCM-41纳米粒子作为药物传输载体负载布洛芬,取得了非常好药物控释效果。与传统纳米药物载体相比,介孔二氧化硅纳米粒子具有比表面积大、尺寸可调、形貌可控、水热稳定性高和较好的生物相容性[4-5]。二氧化硅作为药物载体可以保护药物免受生物体内酶的破坏和降解,提高药物的利用度,降低细胞毒性。因此,介孔二氧化硅纳米粒子在药物传输领域具有非常大的发展潜力,是新型药物制剂的研究方向[6]。

尽管二氧化硅在药物传输中取得了很多成果[7-9],但是它也存在一些缺陷。由于二氧化硅表面含有大量的硅羟基,使其对疏水药物的负载和释放能力较弱[10]。然而,化疗中药物大都是疏水性[11],如何能够提高二氧化硅对疏水性药物的负载成为当今热点领域。

二氧化硅的孔径、比表面、孔容量和表面性质均会影响其对药物的负载能力[12-16]。当前,提高二氧化硅对疏水性药物负载能力最有效的方法是增加其表面的疏水性。Wang等[17]在二氧化硅的合成过程中加入表面修饰剂,通过共沉淀法制备得到具有不同疏水强度的二氧化硅,实验表明,用乙烯基或巯丙基修饰过二氧化硅后,能够增加其对罗丹明的负载量。然而这种共沉淀修饰法会将官能团埋藏在二氧化硅基质内,降低了官能团在MSN表面的修饰量[18-19]。本实验在介孔二氧化硅制备完成后对其进行氨基化修饰,使氨基能够分布在MSN表面,改善其对疏水性药物的负载能力。

本实验首先探讨不同的反应条件来制备二氧化硅粒子,通过二氧化硅对盐酸非索非那定(FXD)的负载效率来确定最适宜制备工艺;其次,采用不同添加量的γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)对二氧化硅进行氨基化修饰,提高其对疏水性药的负载能力和药物缓释能力;最后,通过Korsmeyer-Peppas方程对载体释放数据进行拟合分析,确定药物释放速率常数和释放指数,探讨药物释放机理[20]。

1 实验部分

1.1 主要实验仪器和试剂

1.1.1 主要实验仪器

1.1.2 主要试剂

十六烷基三甲基溴化铵,天津市光复精细化工研究所;无水乙醇,天津市光复科技发展有限公司;γ-氨丙基三乙氧基硅烷,江苏晨光偶联剂有限公司;氢氧化钠,天津市北方化玻购销中心;盐酸非索非那定,天津天士力制药股份有限公司;正硅酸乙酯,天津市博迪化工有限公司;磷酸二氢钾,天津市光复科技发展有限公司;磷酸氢二钠,天津市光复科技发展有限公司;pH缓冲液,上海雷磁创益仪表有限公司;碳酸氢钠,天津市江天化学有限公司

1.2 盐酸非索非那定标准曲线的绘制

精确称取FXD 25 mg,加5 m L乙醇使其完全溶解,将溶液移到250 m L容量瓶中,用 PBS缓冲液(pH=7.4)洗涤玻璃棒和烧杯3次,并将冲洗液也转移至容量瓶中,用 PBS缓冲液(pH=7.4)定容。取 7 个 25 m L容量瓶,分别取 1、2、3、4、5、6 和 7 m L的上述溶液加于容量瓶中,以 PBS缓冲液(pH=7.4)为空白参比,用紫外分光光度仪在219 nm处测定各溶液的吸光度[21],以浓度为 X轴,吸光度为 Y轴作图。

1.3 介孔二氧化硅的制备

准确称取一定量的CTAB,置于锥形瓶中,加入60 m L去离子水60℃恒温搅拌30 min。向上述溶液中加入2 mol/L的NaOH溶液,恒温搅拌30 min,逐滴滴加1.2 m L的TEOS到上述溶液中,60℃恒温反应一定时间,离心洗涤沉淀。煅烧去除表面活性剂(2.5 h升温到550℃,550℃保温煅烧3 h),制备得到介孔二氧化硅。

1.4 氨基化二氧化硅的制备

准确称取0.1 g介孔二氧化硅加入到50 m L去离子水中,加入适量冰醋酸溶液将混合液pH值调至4.0,在 80℃水浴中逐滴滴加 0.03、0.05、0.07、0.09和0.11 m L的γ-氨丙基三乙氧基硅烷,冷却回流反应4 h。反应完成后,用无水乙醇洗涤3次,分离出下层乳浊液,放在干燥箱中干燥,制备得到氨基化二氧化硅,分别标记为 MSN-NH2-1、MSN-NH2-2、MSN-NH2-3、MSN-NH2-4 和 MSN-NH2-5。

1.5 二氧化硅对FXD负载和累计释放的影响

1.5.1 二氧化硅对FXD负载

分别取一定质量二氧化硅和氨基化二氧化硅于100 m L锥形瓶中,向锥形瓶中加入40 m L 0.5 mg/m L的FXD溶液,恒温37℃震荡24 h。吸附完成后,5000 r/min的转速下离心 10 min,取5 m L上层清液,稀释20倍,用紫外分光光度仪测定它的吸光度并记为A1,利用FXD标准曲线计算出相应浓度并计为 C。将乳浊液放在表面皿上,在45℃、真空度 0.09 MPa条件下干燥。二氧化硅对FXD负载效率(mg/g)的通过公式(1)计算。

其中,C0为初始 FXD浓度,g/L;C为上清液稀释后FXD的浓度,g/L;M为二氧化硅的质量g;V0为初始FXD溶液的体积,m L。

1.5.2 二氧化硅对FXD累计释放

准确称量10 mg的药物载体于烧杯中,用少量PBS缓冲液将烧杯中的载体转移至透析袋中,用夹子封闭透析袋,将整个透析袋固定在盛有缓冲液的烧杯中,恒温37℃进行药物释放,定时测透析袋外溶液的吸光度并记为A2,利用FXD标准曲线计算出相应浓度并计为Ct。FXD的累计释放率按公式(2)计算。

“毋变天之道,毋绝地之理,毋乱人之纪。”(《礼记·月令》)[5]419儒家在与自然的关系上,要求敬畏天地,顺时而行,应时而作。 在个人与群体的关系上,讲求通过“修身、齐家”至于“治国、平天下”,将个人与群体、家与国联系起来。 在社会秩序方面,主张“仁”和“礼”,要求“父子有亲,君臣有义,夫妇有别,长幼有叙,朋友有信”[6]125。 这些内容体现在国家的政治社会内,同样体现在平常百姓的日常生活中。 儒家认为,礼源于祭,主于敬,致于福。 许慎《说文解字》示部曰:“礼,履也,所以事神致福也。”[7]2

其中,Ct为 PBS缓冲液中 FXD的浓度,mg/m L;V为PBS缓冲液体积,m L;M0为二氧化硅中负载的药物质量,mg。

1.6 表征与测试分析

S-4800型扫描电子显微镜(SEM),日本日立公司。采用喷金法对所测的样品进行制样分析。扫描电子显微镜分析样品的形貌结构。

傅里叶-红外光谱(FT-IR),Nicolette Avatar 370型傅里叶红外光谱仪,美国 Thermo公司,采用溴化钾压片法,分辨率为 0.1 cm-1,使用波长范围为399 ~4000 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 氨基化修饰前后的二氧化硅的形貌分析

图1给出了MSN和MSN-NH2的扫描电镜图。

图1 M SN和M SN-NH2的扫描电镜图片Fig.1 SEM of M SN和M SN-NH2

从图1可以看出MSN和 MSN-NH2具有纳米级球状结构,粒径在100 nm左右,氨基化修饰没有改变二氧化硅的粒径。

2.2 氨基化二氧化硅的FT-ⅠR分析

图2给出了MSN和MSN-NH2-3的红外光谱图,这2种纳米材料均包含硅基材料的红外特征峰。

图2 M SN和M SN-NH 2-3的红外光谱Fig.2 FT-ⅠR spectrum of MSN and M SN-NH 2-3

1100 cm-1波数处为 Si—O—Si反对称伸缩振动峰,800 cm-1波数处为 Si—O—Si对称伸缩振动峰[22-23]。698和1500 cm-1分别对应 N—H弯曲振动峰和—NH3+的对称振动峰,表明硅烷成功修饰在二氧化硅的表面[24]。3400和1604 cm-1波数处分别为O—H伸缩振动峰和O—H弯曲振动[22]。

2.3 盐酸非索非那定标准曲线的绘制

图3给出盐酸非索非那定浓度与吸光度的变化。

图3 盐酸非索非那定浓度与吸光度的关系Fig.3 Curve of concentration-absorbance for FXD

由图3可得,盐酸非索非那定的标准曲线为y=36.25x+0.005(R2=0.9996),线性相关度很好,可以用于FXD含量的测定。

2.4 二氧化硅的制备工艺优化

2.4.1 CTAB浓度对二氧化硅负载FXD的影响

准确称取一定量的 CTAB,加入60 m L去离子水恒温60℃搅拌30 min得到不同CTAB浓度的溶液(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L)。 向上述溶液中加入2 mol/L的NaOH溶液1.0 m L,恒温搅拌30 m in。逐滴滴加1.2 m L的TEOS,恒温反应90 m in,离心洗涤沉淀,煅烧去除 CTAB,将制备得到 MSN用于FXD的负载,研究CTAB浓度对 MSN负载 FXD的影响。结果见图4。

图4 CTAB浓度对FXD负载效率的影响Fig.4 E ffects of concen tration of CTAB on FXD loading capacity

从图4可以看出FXD的负载效率随着CTAB添加量的增加而增高,这是因为随着CTAB浓度的升高,介孔二氧化硅的结构特征发生了改变。一方面,CTAB浓度升高使其更容易在反应液中形成柱状胶束,有利于制备形貌均匀且比表面积大的柱状介孔二氧化硅。另一方面,随着CTAB浓度的升高,合成的二氧化硅粒径逐渐增大,使其比表面积减少。在这两方面的影响下,二氧化硅比表面积出现先增大后减少的趋势,所以二氧化硅对FXD的负载效率随着CTAB添加量的增加出现先升高后减少的现象。当CTAB的浓度为2.0 g/L时,FXD的吸附效果最好,负载率为24.5 mg/g。

2.4.2 NaOH添加量对二氧化硅负载FXD的影响

准确称取0.12 g CTAB,加入60 mL去离子水恒温60℃搅拌30 m in。向上述溶液中加入不同量的 2 mol/L的 NaOH溶液(0.4、0.6、0.8、1.0 和1.2 m L),恒温搅拌 30 min,逐滴滴加 1.2 m L的TEOS到上述溶液中,恒温反应90 min,离心洗涤沉淀。煅烧去除表面活性剂,将制备得到二氧化硅用于FXD的负载,研究NaOH添加量对二氧化硅负载FXD的影响。结果见图5。

图5 NaOH添加量对FXD负载效率的影响Fig.5 Effects of volum e of NaOH on FXD loading capacity

从图5可以看出,NaOH的添加量会影响二氧化硅对FXD的负载效率。在较弱的碱性条件下,由于反应液中水解的硅前驱体吸附的负电荷少,使其很难与表面活性剂胶束结合,容易生成二氧化硅不定性产物。在较强的碱性条件下,TEOS水解速度太快,不容易形成长链低聚态硅胶粒子,过多的硅前驱体会使得有一部分硅源来不及与CTAB胶束结合,生成实心二氧化硅,造成二氧化硅的比表面积下降[25]。因此,只有在合适的 NaOH添加量条件下,才能制备出相貌均匀且比表面积大的二氧化硅粒子。当NaOH的添加量为0.8 mL时,MSN取得最好的吸附效果,FXD的负载效率为25.2 mg/g。

2.4.3 反应时间对二氧化硅负载FXD的影响

准确称取0.12 g CTAB,加入60 m L去离子水恒温60℃搅拌30 min。向上述溶液中加入不同量的2 mol/L的NaOH溶液0.8 m L,恒温搅拌30 m in,逐滴滴加1.2 m L的TEOS到上述溶液中,恒温反应(60、90、120、150 和 180 m in),离心洗涤沉淀。 煅烧去除表面活性剂,将制备得到二氧化硅用于FXD的负载,研究反应时间对二氧化硅负载FXD的影响。结果见图6。

图6 反应时间对FXD负载效率的影响Fig.6 Effects of reaction tim e on FXD loading capacity

从图6可以看出随着反应时间的增加,MSN对FXD的负载效率逐渐升高。在反应液中,CTAB胶束存在不同形态,硅前驱体与胶束之间的作用在短时间内很难达到平衡,造成粒子具有不同的形貌特征。随着反应时间的增加,胶束憎水作用会对纳米粒子进行修饰,纳米粒子内部也有足够的时间进行密堆积,形成形貌均匀的介孔二氧化硅纳米粒子[26]。当反应时间超过120 min后,MSN对FXD的吸附效果趋向平稳,FXD的最大负载效率为28.1 mg/g。

由图4~图6的实验结果可知,介孔二氧化硅纳米粒子的最适宜制备条件为:CTAB的添加量为2.0 g/L,NaOH的添加量为 0.8 m L,反应时间为180 min。在最适宜的制备条件下,MSN对 FXD的最大负载效率为28.1 mg/g。

2.5 氨基化对二氧化硅负载和释放FXD的影响

2.5.1 氨基化对二氧化硅负载FXD的影响

从图7中可以看出,APTS添加量会影响二氧化硅对疏水性药物的负载能力。在一定范围内,随着APTS添加量的增加,二氧化硅表面氨基负载率会增加,有利于吸附疏水性药物。但是APTS的添加量不宜过大,因为过多的APTS会降低二氧化硅的平均孔径和比表面积,使得载体对药物的负载能力大大降低。当APTS的添加量为0.07 m L,MSN-NH2-3吸附量达到最大值,FXD的负载效率为39.3 mg/g。

2.5.2 氨基化对二氧化硅释放FXD的影响

图7 APTS添加量对对FXD负载效率的影响Fig.7 Effects of volum e of APTS on FXD load ing capacity

从图8中可以看出,前10 h,MSN对 FXD累计释放率达到61.7%,MSN-NH2-3对FXD累计释放率为54.7%。当药物累积释放时间达到32 h时,MSN对 FXD累计释放率为 67.7%,MSN-NH2对FXD累计释放率为59.3%。这说明氨基化后,二氧化硅缓释能力得到增强。除了表面修饰以外,还可以通过改变二氧化硅的孔径来调节药物释放速率。Munoz等[27]通过改变表面活性剂的链长制备出具有不同孔径的介孔二氧化硅,当药物的累计释放时间达到30 h时,MCM-41(孔径2.5 nm)对布洛芬累计释放率约为85%,MCM-4116b(孔径1.7 nm)对布洛芬累计释放率约为75%。这2种方法说明氨基化修饰可以更好地降低药物的释放速率。药物的缓释能力增强后可以使药物在体内组织中停留的时间增加,提高药物的利用率,降低药物对生物体的毒害,有利于疾病的治疗。

图8 二氧化硅氨基化对FXD累计释放率的影响Fig.8 Cum u lative release of FXD from M SN and M SN-NH2nanoparticles

2.5.3 氨基化对二氧化硅释放FXD数学模型的建立

从图9可以看出这2种药物载体均具有良好的药物控释效果,为了进一步对比分析不同载体的释放动力学特点,根据文献,选用 Korsmeyer-Peppas方程对释放数据进行拟合分析。Korsmeyer-Peppas方程为:Ft=ktn,t是时间,Ft是时间的释放百分比,k是释放动力学常数,与载体的孔道结构有关,n是释放指数,用于描述药物释放机理[20]。

图9 FXD累计释放的Korsm eyer-Peppas拟合曲线Fig.9 FXD release fitted with the Korsm eyer-Peppasm odel

根据拟合结果,MSN-NH2-3的释放动力学参数(k=13.41)小于 MSN的释放动力学参数(k=19.64),说明氨基化修饰增加了药物释放的传质阻力,氨基化二氧化硅对药物的缓释效果要优于二氧化硅。MSN-NH2-3和MSN的药物释放指数分别为0.63和0.51,说明这2种载体孔道中药物的释放趋向于非Fickian扩散。

3 结论

本实验成功制备出氨基化修饰的介孔二氧化纳米粒子。通过单因素实验确定二氧化硅的最适宜制备工艺条件:CTAB的浓度为2.0 g/L,NaOH的添加量为0.8 m L,反应时间为180 m in,FXD的负载效率达到28.1 mg/g。氨基化后,二氧化硅对 FXD的负载效率升高到39.3 mg/g。FXD的累计释放实验表明,MSN-NH2-3比MSN粒子有更好的药物缓释效果。因此,氨基化修饰在改善二氧化硅对疏水药物的吸附和缓释方面拥有广阔的应用前景。

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