猪戊型肝炎的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，姚春阳，李 峰，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪戊型肝炎的病原学特征及检测技术研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，姚春阳，李 峰，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪戊型肝炎病毒（HEV）感染为国内近年来的新发人畜共患传染病，在猪群中普遍存在，猪是重要的储存宿主和传染源，严重危害着人类健康和畜牧业健康发展。文章概述了猪戊型肝炎病毒的病原学特征及检测技术研究进展，以期为预防和控制疾病提供参考。

戊型肝炎病毒；病原学；检测；研究进展

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由肝炎病毒科戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的一种重要的经消化道传播的人畜共患病，临床上主要表现为急性肝炎。近年来，人感染HEV呈上升趋势，严重危害着人类健康。猪是公认的HEV重要储存宿主和传染源，我国作为生猪养殖大国和以猪肉消费为主的国家，为了控制HE的传播和流行，同时也为了减少HEV对人类的危害和食品公共卫生安全，必须从源头上控制该病原。本文简要概述了猪HEV的病原学特征及检测技术研究进展，以期为防治该病提供参考。

1 病毒的由来和发现

Meng等（1997）[1]首次从美国的猪体内鉴定出HEV。我国孙中锋等（2006）[2]将分离到的5个猪源HEV病毒株和3个人源病毒株进行检测并测序，证实分离到的病毒株均为基因4型，而且同源关系较高，揭示了HEV存在种群交叉感染的可能。宁海强等（2007）[3]检测了上海近郊收集的36份样品，检测得到5份阳性样品，阳性率达到13.9%。通过序列分析发现，上海猪HEV同样属于基因4型。陆一涵等（2007）[4]首次在上海猪群中检测到基因3型HEV。我国研究人员近年来分离到的猪HEV多数为基因4型，表明我国HEV感染占主导地位的是基因4型。

2 病毒的形态及分类地位

HEV是单股正链RNA病毒，呈球形，直径32～34 nm，无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称，基因组长约7.2 kb。HEV只有一个血清型，但具有高度的遗传多样性。目前戊型肝炎主要分为4类，分别为A类肝炎（人、猪、野猪、鹿、兔子、骆驼等）、B类肝炎（禽类）、C类肝炎（鼠、大袋狸、亚洲麝香鼩、雪貂）和D类肝炎（蝙蝠）。其中A类戊型肝炎又可以分为7个型：基因1型和2型仅发现于人类，具有一定的地域性，主要存在于发展中国家如亚洲、非洲以及美国中部地区；基因3型和4型宿主范围广，人畜均可感染，基因3型分布在美国、日本、法国、荷兰、澳大利亚、加拿大、阿根廷等发达国家；基因4型分布在中国、日本、印度和越南；基因5型和6型主要感染野猪；基因7型感染骆驼。在我国HEV感染以基因1型和4型为主，4型多见。猪HEV感染均为基因3型和4型。

3 病毒的流行病学特点

猪是HEV重要的自然宿主及传染源。HEV在猪群中普遍存在，以水源性暴发和急性散发为特点，主要通过被感染的水和食物经粪-口途径传播，也可经血液、母婴等途径传播，具有重要的公共卫生学意义，主要流行于发展中国家，在发达国家呈散发状态。HEV可在肝脏和胆汁中蓄积，同时也可以在小肠及大肠内增生。猪HEV经口侵入机体，从肠道经门静脉感染肝细胞，在肝细胞质内增生，增生的子代病毒可进入血液出现短暂的病毒血症，并可分泌进入胆汁中。病毒主要随胆汁一起经粪便排出体外，带病毒的粪便可再次经口引发新的感染。

4 病毒检测技术研究进展

4.1 免疫电镜（immunoelectron microscopy,IEM）观察

Balayan等（1983）[5]首次运用免疫电镜技术在急性肝炎患者及志愿者的粪便中发现并证实了HEV的存在。HEV感染潜伏期和急性期患者的粪便和胆汁中存在大量的HEV病毒颗粒，可用IEM进行检测。但是该方法在实际应用中受到一定的限制，原因是HEV通过粪便排毒持续时间短，加之在消化道时大部分病毒颗粒易被降解，完整的HEV少，所以临床检测比较困难。而且免疫电镜灵敏性较差、重复性差，又需要特殊的设备条件和专门的技术人员，这就使其应用受到了较大的限制。

4.2 血清学检测技术

4.2.1 免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）免疫荧光试验可用于检测HEV抗原或抗体，临床常用的有直接法和间接法。Purdy等（1994）[6]应用荧光素标记的HEV患者的血清，直接法检测标本中HEV抗原。Zhu等（2013）[7]运用IFA对肝脏组织中的HEV抗原进行检测。李丹丹等（2008）[8]利用抗HEV ORF2蛋白单克隆抗体能阻断荧光标记的抗HEV的抗体与标本中的HEV抗原反应，建立间接免疫荧光检测HEV抗体。IFA敏感性高、特异性强，但需取急性期肝组织检查，且需要荧光显微镜，因此不适合HEV的常规检测。

4.2.2 血清中和试验（serum neutralization test,SNT）血清中和试验不仅可以对病毒的种型鉴定还可以测定血清抗体效价。Meng等（1998）[9]用不同毒株的阳性血清对不同地域的HEV毒株进行中和试验发现，HEV只有一个血清型。

4.2.3 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunos orbentassay,ELISA） ELISA是目前用于检测血清中HEV抗体最常用的方法。ELISA方法主要分为固相ELISA法、夹心ELISA法和间接ELISA法等。ELISA包被抗原包括全病毒抗原、合成肽抗原、表达抗原以及重组蛋白抗原。Meng等（1997）[1]利用从SF9细胞中表达出的人HEV（Sar55）ORF2重组蛋白作为ELISA包被抗原使用阻断ELISA来检测HEV抗体，检测出美国中西部猪群的HEV抗体阳性率。Yoo等（2001）[10]利用大肠杆菌表达的重组HEV ORF3蛋白作为包被抗原检测猪HEV抗体亦获成功。张可心等（2006）[11]采用巢式RT-PCR技术扩增HEV结构蛋白基因ORF2部分片段AG02并进行重组表达，以分子量为33 kDa重组蛋白建立了初步的间接ELISA方法。曲娟娟等（2007）[12]采用大肠杆菌表达的HEV ORF2部分蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，并对黑龙江省、吉林省猪场480份猪血清样品进行检测，阳性率分别为62%、75%，与商品化试剂盒符合率为98.6%。刘涛等（2009）[13]建立了基因4型HEV重组ORF3蛋白抗原间接ELISA方法，检测190份猪血清样品，阳性率为84.7%，为进一步开发4型HEV抗体检测试剂盒奠定了基础。刘启文等（2010）[14]通过猪HEV ORF3筛选出来的一段序列合成肽建立了间接ELISA方法。闻晓波等（2010）[15]应用原核表达的重组蛋白ORF2-C和ORF2-N作为检测抗原建立ELISA方法。刘艳玲等（2012）[16]用双抗原夹心ELISA检测广西14个市猪群HEV抗体，阳性率高达77.3%。曲立春（2014）[17]采用双抗原夹心法对黑龙江鸡西地区采集的600份猪血清样本进行检测，HEV阳性率为19.33%。唐建华等（2015）[18]利用双抗原夹心ELISA方法对西藏自治区拉萨市、墨竹工卡、工布江达及林芝县等地12个乡镇藏猪1 440份血清进行HEV抗体检测，结果12个乡镇藏猪均有HEV抗体，HEV抗体平均阳性率为41.32%，表明HEV普遍存在于拉萨-林芝公路沿线。杜宁（2016）[19]应用双抗原夹心ELISA对采集自攀西地区猪血清样品245份进行HEV感染情况调查，结果表明该地区猪群中HEV感染很严重。陈宜阳（2016）[20]通过原核表达制备的基因4型猪HEV的ORF2蛋白sORF2-C作为包被抗原，制备和HRP标记的抗sORF2-C蛋白的单抗HRP-1E4作为阻断抗体，建立了猪HEV特异性抗体的阻断ELISA方法，具有较好的敏感性、特异性和重复性。我国已利用大肠杆菌表达出HEV结构蛋白作为抗原成功研制了抗HEV IgM和IgG抗体诊断ELISA试剂盒，经中国药品生物制品检定所检定后，已经用于我国HE的临床诊断和流行病学调查。但ELISA方法由于使用的包被抗原不同所以对恢复期HEV IgG的检测结果不尽相同，从而限制了血清学检测结果的可信性。

4.2.4 蛋白质印迹法（western blotting,WB） 蛋白质印迹法又称免疫印迹法，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。李凡等（1995）[21]建立了免疫印迹法检测抗HEV IgG，结果表明HEV暴发点急性肝炎病人血清抗HEV IgG的阳性率高于ELISA，具有良好的灵敏度和特异性。Thiry等（2014）[22]用免疫印迹法对ELISA方法进行评价，发现免疫印迹法检测虽然特异性高，但操作过程相对复杂，耗时较长。

4.2.5 免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoper oxidase monolayer assay,IPMA） Liang等（2014）[23]用构建的pcDNA3.1-ORF3转染真核细胞系HepG2，建立了一种检测HEV的免疫过氧化物酶单层细胞试验用于检测HEV抗体。

4.3 分子生物学检测技术

4.3.1 RT-PCR技术 PCR可较灵敏地检出病毒RNA，是最常用的分子生物学检测方法。Meng等（1997）[1]率先应用套式RT-nPCR检测到猪HEV。张维谊等（2009）[24]用建立的RT-nPCR方法对127份猪胆汁样品进行HEV检测，阳性率为7.09%。Huang等（2002）[25]用RT-PCR方法对美国96份猪粪便进行HEV检测，阳性率为35%。张潇等（2005）[26]在132份猪粪便标本中检出13份为HEV阳性，阳性率为9.85%，在160份猪胆汁标本中有11份为阳性，阳性率为6.88%。宋腾飞等（2011）[27]建立RT-nPCR方法并对从山东省泰安某屠宰场收集的106份猪胆汁样品进行了检测，阳性率为30.2%。张序等（2011）[28]也建立了HEV的RT-nPCR方法，并对江西省部分猪场采集的胆汁及肠容物进行检测，结果胆汁中的阳性率为10%，肠容物的阳性率为4%。郝宝成等（2011）[29]也应用建立的RT-nPCR对在甘肃省部分地区采集的255份猪粪便或猪胆汁血清样品进行了检测，阳性率为4.71%。许锋（2011）[30]通过RT-PCR对从河南省郑州、中牟、新郑、济源和濮阳等5个地区采集的200份粪便样品进行HEV检测，HEV阳性率为7.5%。Qiu等（2014）[31]建立了一步法RT-nPCR用于同时检测甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒。贺微等（2017）[32]应用RT-nPCR对广西南宁周边猪场采集到的104份新鲜猪粪便进行HEV检测，结果表明，广西猪群中流行的HEV均为基因4型，且以4a亚型为优势流行毒株。

4.3.2 实时荧光定量RT-PCR技术 荧光定量RT-PCR具有良好的扩增效率、特异性和稳定性，且检测灵敏度比普通RT-PCR高10～100倍。邱蜜蜜等（2010）[33]根据HEV ORF2保守区设计引物及探针，建立了TaqMan探针法荧光定量RT-PCR。张亮权等（2011）[34]根据HEV的ORF2保守区域设计引物，建立了SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR。张晓峰等（2011）[35]利用所建立的荧光定量PCR对浙江及其周边的上海、江苏等地区的猪场环境进行了检测发现，几乎所调查的猪场均存在HEV，感染阳性率高达20.5%。陈小金等（2016）[36]建立了基因3型HEV荧光定量RT-PCR方法。闫蕾等（2016）[37]根据HEV基因ORF2保守区设计引物及探针，建立HEV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。对黑龙江省临床收集的131份样品（肝脏45份、粪便86份）进行检测，总阳性率为11.45%，其中肝脏阳性率为22.22%，粪便阳性率为5.81%。荧光定量PCR为HEV的快速检出及绝对定量奠定了良好的基础。

4.3.3 基因芯片技术 王治伟等（2010）[38]制备HEV检测基因芯片并进行杂交验证，结果表明，HEV检测基因芯片杂交后得到的探针荧光强度好，信噪比高，RT-PCR验证后得到的电泳结果与芯片试验一致，为实验室检测HEV提供了一种快速平行的检测方法。Wutz等（2013）[39]以固定化的基因1型和3型HEV重组抗原建立了化学发光免疫芯片。纪方晓（2016）[40]在建立用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV）Nsp7抗体、猪流感病毒（Swine Influenza virus,SIV）HA抗体及HEV ORF2抗体3个液相蛋白芯片单一检测方法的基础上，同时建立了检测 HEV、PRRSV、SIV 3种抗体的多液相蛋白多重检测方法，为HEV、PRRSV、SIV抗体监测提供了一种高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系。

4.3.4 高效液相色谱（Size-exclusion HPLC,SEHPLC）技术 王宁等（2011）[41]采用分子尺寸排阻高效液相色谱（Size-exclusion HPLC,SE-HPLC）法检测HEV病毒样颗粒VLP，可对HEV VLP进行定性、定量分析。

4.3.5 RT-PCR-ELISA Seo 等（2012）[42]以 RT-PCR和ELISA为基础建立了敏感性高、特异性好的RTPCR-ELISA方法用于HEV的检测。

5 小结

HEV是新发的重要人畜共患传染病之一，分布范围广，严重危害人类身体健康和畜牧业健康发展，在发达国家的发病率呈上升趋势，是发展中国家的主要公共卫生问题之一，HEV准确快速的检测对该病的防控具有重要意义。猪感染HEV后，很少有明显的临床症状，这对HE的临床诊断带来很大的不便，需要进行实验室诊断。从首次发现HEV以来，研究者建立了多种HEV的检测方法，为HEV的相关研究奠定了技术基础，但这些方法各自存在一定的局限性，而且疾病有效疫苗尚未研制成功，因此HEV的防控还需要研究者的深入研究。相信随着分子生物学技术的不断发展，更加灵敏高效特异的检测方法很快会被研制出来，使得HEV的检测手段更加先进，检验结果更加可靠。

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（编辑：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)05-0117-04

2017-07-17

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）

庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，副研究员，硕士，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制.

E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com