长链非编码RNA HOTAIR在胰腺癌中的表达

胰腺癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，近年来发病呈增高趋势，患者早期症状不典型，诊断时多为中晚期。目前手术和化疗效果均不佳，亦无特异的靶向治疗药物，预后差，因此积极探索研究新的分子生物学检测指标及治疗靶点是今后研究的方向。

长链非编码RNA（Long non-coding RNAs，LncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸残基（nt）的RNA分子[1]，位于细胞核内或细胞质中。LncRNA数量众多，剪切位点稳定，具有特定的二级结构和表达的时空特异性，在表观遗传学、转录及转录后等多种层面调控基因的表达水平[2]，是目前肿瘤研究热点。

HOTAIR（HOX transcript antisense RNA）是一种长的基因间非编码RNA，与肿瘤的大小及侵袭能力相关[3]。与乳腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关，而在胰腺癌中的表达水平尚不明确。本研究通过荧光定量PCR的方法检测我院胰腺癌患者HOTAIR的表达情况，为后续研究HOTAIR在胰腺癌中的作用机制及与临床病理关系等研究奠定基础。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集2010年10月—2016年12月山西医科大学第一医院普外科诊断明确的胰腺癌标本共54例。男性33例，女性21例。年龄31～75岁，平均年龄（59.0±8.5）岁。按Klopper标准对原发胰腺癌进行组织学分级，分为高分化、低中分化37例；临床分期按2002年UICC胰腺癌TNM分期系统分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。对照组为良性胰腺手术者（如胰腺外伤、胰腺囊肿内引流术），共10例。

1.2 提取RNA

手术当时收集胰腺癌及其转移灶和正常组织约1 g，用DEPC处理过的生理盐水将血液洗净，经液氮速冻后贮存在-80℃冰箱保存。实验时在Trizol 裂解液中研磨组织。4℃，5 000转，3分钟离心，弃沉淀，吸取上清液至新的EP 管中。提取RNA后加入RNase-free水至完全溶解，测定所抽提 RNA 的浓度及质量。

1.3 反转录cDNA

使用快速链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）根据制造商的说明书从总RNA合成cDNA。

1.4 荧光定量PCR反应

使 用 SYBR Premix ExTaq II试 剂 盒（Takara， 大 连， 中国）通过实时PCR测定HOTAIR的表达，扩增产物。引物：HOTAIR 上 游 5’-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3’， 下游 5’-ACATA AACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’；GAPDH 上 游5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游5’CACCCTGTTGCTG TAGCCAAA-3’。将GAPDH设定为内源对照。反应条件：95℃，30 s；95℃，5 s：60℃，30 min，40个循环反应。通过2-△△Ct方法测定HOTAIR的相对表达。

1.5 统计学方法

使用SPSS22.0软件进行统计学分析，组间比较用方差分析，P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病例临床特征

共收集54例胰腺癌标本。男性33例（61%），女性21例（39%）；高分化17例（31%），低中分化37例（69%）；有淋巴结转移23例（43%），无淋巴结转移31例（57%）；I、Ⅱ期34例（63%），Ⅲ、Ⅳ期20例（37%）。

2.2 HOTAIR基因在胰腺癌及胰腺良性病变组织中的表达水平

通过qRT-PCR检测胰腺癌患者中HOTAIR mRNA的表达水平，54例胰腺癌组织的表达量为（1.24±0.64），癌旁正常组织的表达量为（1.00±0.62），胰腺良性病变组织的表达量为（1.03±0.61）。HOTAIR在胰腺癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）；HOTAIR在胰腺癌组织中的表达水平高于胰腺良性病变组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 HOTAIR在胰腺癌中的表达与临床病理特征的相关性分析

将I、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期患者的HOTAIR水平进行统计学分析，Ⅰ，Ⅱ期（1.32±0.69）；Ⅲ、Ⅳ期（1.21±0.71），结果显示，两组间无统计学差异（P＞0.05）。通过对有无淋巴结转移样本分组统计分析，有淋巴结转移（1.15±0.64）；无淋巴结转移（1.24±0.66），结果未见有统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

近年来，长链非编码RNA（LncRNA）是肿瘤领域的研究热点，它可以通过染色质重编程，增强子顺式调控和mRNA加工转录后调控等机制在生物发育和病理过程中起重要作用，与生物进化、胚胎发育、物质代谢以及人类多种重大疾病关系密切而受到人们广泛重视[4]，是生命活动中发挥重要作用的关键调控分子，而且越来越多的LncRNA已被鉴定为癌基因或参与肿瘤发生的肿瘤抑制因子[5]。由HOXC座位转录的lncRNA HOTAIR （HOX转录反义RNA，HOX transcript antisense RNA），是第一个被发现具有反式转录调控作用的LncRNA，长度2.2 kb，能同时结合多梳抑制复合体2（PRC2）和组蛋白去甲基化酶复合体（LSD1），并介导这2种复合体结合到特异性的基因组位点。HOTAIR在乳腺癌、结肠癌、胃癌等肿瘤组织中过表达[6-8]。siRNA下调肝癌细胞HOTAIR表达后，癌细胞运动能力、侵袭能力均降低，并对顺铂和阿霉素更敏感。

在本次实验中，HOTAIR在胰腺癌标本中的表达水平高于正常胰腺组织，进一步证实了HOTAIR与胰腺癌相关，是潜在的诊断治疗靶点之一。然而，由于病例数的限制，未能进一步分组讨论HOTAIR与胰腺癌病理类型、临床各指标及生存期之间的关系。目前HOTAIR具体在胰腺癌中的生物学作用及其机制尚不明确，通过分析胰腺癌细胞和正常细胞的表达谱，进一步研究lncRNA的生物学功能及其在胰腺癌中的调控机制，能够更全面的理解胰腺癌的发生转移机制，为在更深层次阐明胰腺癌分子机制提供了新思路，寻找新的疾病诊断标志物以及治疗靶点及治疗提供新方法。

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