鹿源中药材的DNA条形码鉴定研究进展※

张辛宁 许亮* 才丽平 王孟虎 夏静文 王友辰

（1辽宁中医药大学药用植物教研室，辽宁大连116600；2辽宁中医药大学中医基础教研室，辽宁沈阳110847）

鹿源中药材的DNA条形码鉴定研究进展※

张辛宁1许亮1*才丽平2王孟虎1夏静文1王友辰1

（1辽宁中医药大学药用植物教研室，辽宁大连116600；2辽宁中医药大学中医基础教研室，辽宁沈阳110847）

鹿源中药材的来源复杂多样，鉴定方法也有很多，如基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等。但在实际应用中，鹿源中药材的鉴定难度极大，一般的鉴定方法很难满足其鉴定要求，因此需要一种快速有效的鉴定方法来鉴定鹿源的真伪和质量。本文以网络文献检索与手工检索相结合的方法，梳理了近20年的文献进行综述。

鹿源；DNA条形码；中药鉴定

鹿源药材为名贵中药材。《中华人民共和国药典》2015版（一部）规定：鹿茸来源为鹿科动物梅花鹿Cervus Nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。药材市场上约有10多种鹿源药材，如鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等，由于鹿茸的品种、年生等不同，鹿茸质量也就不同，肉眼难以轻易辨别，再加上市场上常用牛、驴等或不同品种来冒充正品，所以在鹿源市场上常有以劣充优、以假乱真的现象，给鉴定的准确性带来了一定难度。一般传统的鉴定方法由于其主观性较大、对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强、通用性较差、特异性不强等，存在一定局限性，不利于建立规范化、标准化的鉴定方法[1-3]。目前，在鹿茸等贵重药材及其原动物的分子鉴定方面有不少文献报道采用了分子标记方法，此方法具有灵敏性高、准确性好、重现性好、简单快速等优势[4]。近些年DNA条形码在国内外引起广泛关注，COI(cytochrome c oxidase subunit I)基因的DNA条形码技术具有强大的物种鉴定可靠性，因此成为目前常用的物种鉴定技术手段[5]。

1 鹿源中药材的应用

随着中医药知识的普及，预防、治疗与保健更为人们所接受。远在汉代就有“鹿身百宝”之说。所以，鹿源类中药材更为人们所青睐。

《本草纲目》载鹿产品入药，达17种。《中华人民共和国药典》1977版（一部）收录鹿角、鹿角胶、鹿角霜、鹿茸4味中药[6]。在此之后，各版《药典》一直沿用至今。《中药大辞典》1977年版收录鹿茸、鹿角、鹿血、鹿筋等18个条目，原动物均为鹿科动物梅花鹿或马鹿，对麋鹿茸则另设条目记载[7]。《中华本草》1999年版收录鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等20个条目。同时，分别对水鹿茸、麋鹿茸和狍茸等作了记载[8]。鹿产品的临床使用与记述，品种日渐增多，且更加详细。

鹿产品大多具有滋补、强壮作用。《本草纲目》将鹿茸收载于兽部第五十一卷，记载:“鹿茸生精补髓、养血益阳、强筋健骨、治一切虚损、耳聋、目暗、眩晕、虚痢”。《本草品汇精要》记载鹿肾:“主补肾气。”《名医别录》谓鹿肉:“补五脏，调血脉”。鹿角温肾阳，强筋骨，行血消肿。鹿角胶温补肝肾，益精养血。鹿角霜温肾助阳，收敛止血。鹿茸壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。鹿产品中有滋补强壮作用的还有，鹿血、鹿尾、鹿骨等。

我国是主要的产鹿国之一，鹿科的动物品种繁多，有10属，18种在中国曾经产或现在仍产[9]。由于资源有限，价格高昂，给分析鉴定带来一定难度，药材市场上经常出现使用其他动物药材充当鹿茸、鹿角等药材出售的现象，以假乱真扰乱医药市场秩序。鹿角为鹿科动物马鹿或梅花鹿已骨化的角或锯茸后翌年春季脱落的角基，分别习称“马鹿角”“梅花鹿角”“鹿角脱盘”。鹿茸来源为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。鹿角胶、鹿角霜等也都是在鹿角的基础上加工而成。鹿源品种来源虽多，但《药典》规定正品均来源于鹿科动物马鹿或梅花鹿，而药材市场上出现过用其他动物药材如驼鹿Alces alces Linnaeus、驯鹿Rangifer tarandus Linnaeus、狍（子）Capreolus capreolus Linnaeus、麋鹿Elaphurus davidianus MilneEdwards、白唇鹿Cervus albirostris Przewalski等以及其他动物的骨块[10-11]来充当鹿茸、鹿角等药材出售。鹿茸伪品还有用鹿皮、羊等包制成囊套，也有将各种鹿角切成薄片来冒充鹿茸片。这些因素都严重影响了鹿源中药材的质量，所以更需要一种简便、快速的鉴定方法。

2 DNA条形码鉴定技术

DNA条形码（DNA barcoding）技术是一种新兴的、崭新的分子鉴定体系，即通过比较一段通用DNA序列，对物种进行快速识别与鉴定，在生物物种鉴定方面有着广阔的发展前景，目前该技术已成为物种分类和鉴定的研究热点，相信随着研究的深入，必将大大加快中药鉴定标准化的进程[12-14]。DNA条形码数据库既是存储DNA条形码序列的工具，又是DNA条形码和物种分析鉴定研究的平台，对推动DNA条形码研究发展具有极其重要的意义[15]。DNA条形码鉴定技术是按照不同物种的DNA序列均是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）四种碱基不同顺序排列而成，因此，可以对某一特定的DNA片段序列进行分析鉴定，从而区分不同物种。近年来，中药DNA条形码分子鉴定得到快速发展，目前已经取得阶段性成果，对推动DNA条形码研究发展具有重要意义。

从DNA条形码概念提出到现在发展研究阶段，“通用条形码”的选择一直都是人们最关注的问题之一。动物类药材选用细胞色素C氧化酶1的线粒体COI基因作为DNA条形码已基本形成共识。对于动物，Hebert将编码细胞色素C氧化酶的线粒体基因COI作为DNA条形码，随后对昆虫、鸟类和鱼类鉴定的研究结果表明COI条形码作为DNA条形码应用于动物物种识别具有可靠性[16]。除此之外，以核糖体为代表的其他一些基因标记也被认可作为动物DNA条形码使用。DNA核酸序列和特异引物PCR扩增的方法也常用于鉴定动物类药材如鹿茸、鹿鞭、乌梢蛇、鳖甲等[17-19]，这些研究都取得了良好的效果。近些年来，国内外学者做了大量的COI实验，结果表明COI具有很高的通用性，能够有效并且快速地鉴别动物物种。

鹿源类药材鉴定仍然存在一些问题。首先，《中国药典》规定了梅花鹿和马鹿这2个种，而并非某个产地，而不同产地之间就会存在差异；其次，对同一物种不同药用部位如:角、血、鞭、筋、肉，甚至毛等DNA序列的比对难度很大。由于属间及其以上DNA序列的差异远大于同属种间的差异，所以，从DNA水平上最具鉴定意义的是同属内动物药材的鉴定，因此在DNA水平上关键的是要找出DNA种间水平的差异[20]。本文应用DNA条形码技术来鉴别传统方法难以鉴别的鹿源中药材领域。鹿源类中药DNA条形码鉴别方法相比于传统的鉴别方法，具有以下几个显著特点：第一，可重复性。直接利用DNA序列进行鹿源的鉴定，具有可重复性。在鹿源个体发育过程中DNA序列不会随之改变，虽然经过加工，形态可能发生变化，但DNA序列信息在此过程中不会改变，即使样本部分受损也不会对识别结果产生影响；第二，快速、高效。特定的鹿源中药材具有特定的DNA序列信息，不会因为形态上的趋同而导致物种的鉴别失误，并且易于构建庞大的鹿源DNA数据库，从而可以快速的鉴定大量样本。第三，确定性。可获得由四种碱基组成的核苷酸序列所构成的鹿源的明确数字信息，弥补了形态描述含糊不清的不足。第四，方便性，只需一对或几对通用引物，在不同鹿源中药材之间进行对比鉴定，在全球鹿源中药材鉴定中可以形成统一的标准，任何人都可以利用DNA数据库，方便序列的比对，使鹿源鉴定更为规范易行，标准化的分子条形码数据库甚至使专业领域以外的人运用自如。第五，可以有效地区别鹿源形态相近的近缘种。DNA条形码的应用，将使人们用药更加准确、安全，使人们基本告别伪劣产品，准确辨别各种鹿源药物。

3 DNA条形码技术在鹿源类中药材鉴定的应用

目前，鹿类药材的鉴定方法有传统鉴定，如形状鉴定、显微鉴定、理化鉴定[21-23]，和分子鉴定方法，如基于特异引物PCR扩增和COI条形码序列。研究鹿科动物的线粒体DNA(mtDNA)较多[24]。利用mtDNA的研究目前也有一些进展，分析梅花鹿和日本鹿的遗传变异时利用了mtDNA控制区；分析鹿属动物的多态性时利用到了mtDNA[25]；近几年，唐双焱等[26]利用细胞色素b基因和特异性PCR片段，从鹿血，鹿茸和伪鹿茸中提取mtDNA，鉴定鹿茸药材的真伪。王学勇等[27]研究了9种近源物种鹿科动物鹿茸药材的位点特异性PCR鉴别方法；白根本等[20]利用线粒体12S rRNA基因片段，从马鹿、梅花鹿等国内11种鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA，鉴定马鹿茸和梅花鹿等珍贵中药材。李仁茂等[28]利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对梅花鹿筋、新西兰鹿筋、牛筋等五种动物筋进行了电泳分析，得出鹿筋与其他四种动物筋具有显著差异。郭月秋等[29]用免疫凝集试验鉴别鹿鞭及其伪品。王建云等[30]用线粒体DNA细胞色素b的方法鉴定了鹿鞭。赵静雪等[31]分析比较不同DNA提取方法对鹿骨类药材的提取质量，从而选择高质量的提取方法，获得高质量的DNA，用于PCR扩增，进行对比鉴定。崔丽娜等[10]利用COI序列对鹿茸及其混伪品进行DNA条形码鉴别。另外，张蓉等[32]也利用COI基因序列，设计一对鹿科动物DNA条形码通用引物，对于不同来源的鹿茸样本进行准确鉴定。以上对鹿类药材的鉴定方法繁多，在一定程度上不够完善，缺乏统一的鹿类药材鉴定方法。

4 小结与展望

药材市场上的鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等鹿源系列中药代用品、习用品、混伪品较多，导致市场上商品药材复杂混乱，用常规方法鉴定具有一定局限性。中药鉴定以确保中药品种正确、质量优良，安全、有效、稳定、可控。中药材的准确鉴定至关重要，直接影响到中医临床用药的安全和疗效。随着分子生物学的高速发展以及DNA序列自动分析仪的普及，使DNA分子鉴定的逐渐成本降低，有利于将此技术引入中药材的检验中。把DNA条形码鉴定方法用于鹿源的鉴定，可以快速鉴定鹿茸、鹿鞭、鹿尾、鹿筋等，有利于鹿源鉴定标准化的实现，能加速构建庞大的、统一的鹿源DNA数据库，极大地提高分析效率，以实现更加便捷经济的鹿源鉴别模式，制定出切实可行，有利于推广应用，实用性强的有效的鉴定方法，澄清其混乱现象，确保用药准确、有效，必将带来更大的社会和经济效益，推动生物分子鉴定的发展进程。

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Research Progress on Chinese Herbal Medicine Luyuan DNA Barcode Identification

ZHANG Xinning1,XU Liang1*,CAI Liping2,WANG Menghu1,XIA Jingwen1,WANG Youchen1
(1.Department of Medicinal Plants,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China 2.Department of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Universityof Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang 110847,China)

The source of Chinese medicinal herbs luyuan is complex and diverse,and identification methods have many,such as the basis of identification,characterization,microscopic identification and physical and chemical identification.However,in practical application,the identification of Chinese herbal medicines luyuan is very difficult,and the general appraisal method is difficult to satisfy the identification requirements,so a fast and effective identification method is needed to identify the authenticity and quality of strephococcus.This paper summarized the literature of nearly 20 years by combining the method of network literature retrieval and manual retrieval.

luyuan;DNA barcodes;identification of traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.062

1672-2779（2017）-16-0144-03

：李海燕本文校对：王冰

2017-04-10）

国家商务部项目中央本级重大增减支项目【No. 2060302】；国家中医药管理局项目【No.201407002】；大学生创新创业训练计划项目；辽宁中医药大学杰出青年基金【No. 20121228】；辽宁省高等学校杰出青年学者成长计划【No. LJQ2014101】

*通讯作者：861364054@qq.com