注射剂中小粒径不溶性微粒对炎症相关指标的影响

钱江辉 张秀磊 陈沁月 沙先谊

注射剂中小粒径不溶性微粒对炎症相关指标的影响

钱江辉 张秀磊 陈沁月 沙先谊

目的 探讨4种盐酸氨溴索注射剂中小粒径不溶性微粒在小鼠体内对相关炎症指标的影响。方法 比较4种制剂不同剂量下所含不溶性微粒静脉给药后对小鼠血清及肺组织中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的影响；比较不同制剂高剂量所含不溶性微粒对小鼠肺和尾静脉组织结构的影响。结果A制剂低剂量组对小鼠血清NO水平没有显著性影响（P＞0.05），而其他各组与对照组相比NO水平均明显降低，且呈一定剂量依赖关系；各制剂高剂量组小鼠血清MDA水平均明显高于对照组，尤其是D制剂高剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；各组中除A制剂和B制剂低剂量组外，其余制剂组小鼠血清SOD水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；B、C制剂高剂量组和D制剂低高剂量组小鼠肺组织中MDA水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；D制剂高、低剂量组小鼠肺组织中SOD水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而其他各组与对照组相比差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论盐酸氨溴索注射剂中小粒径不溶性微粒对炎症相关指标有不同程度的影响。

盐酸氨溴索；注射剂；不溶性微粒；炎症；质量评价

静脉注射液中不溶性微粒可使患者出现严重不良反应，近年来已逐渐引起医疗人员的关注，如不溶性微粒可造成局部组织缺血、严重肺功能障碍甚至病死[1]。目前，包括中国在内各国药典对注射剂中控制的不溶性微粒是＞10 µm和＞25 µm两种粒径，对于小于10 µm的不溶性微粒没有控制要求[2]。在前期研究中已报道了注射剂中存在数量庞大的小粒径不溶性微粒（平均粒径为1 µm左右），并且粒子数量在同一品种不同上市制剂之间存在明显差异性[3]。

目前，由于缺乏标准的体内检测方法及伦理方面原因，还难以从临床研究中得到准确证据。本研究以盐酸氨溴索注射剂作为模型药物，评价不同制剂中小粒径不溶性微粒在动物体内对炎症相关指标的影响，旨在为该药物的临床用药安全提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料BALB/c小鼠90只，雌雄各半，年龄7～8，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。盐酸氨溴索注射液：A厂（批准文号：国药准字J20140032，规格：15 mg:2 ml），B厂（批准文号：国药准字H20041473，规格：15 mg:2 ml）；注射用盐酸氨溴索：C厂（批准文号：国药准字H20031344，规格：30 mg），D厂（批准文号：国药准字H20050243，规格：15 mg）；甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA，美国）；其他试剂均为分析纯；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物试剂有限公司）；Sartorius BS210S分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Synergy2多功能酶标仪（BioTek，USA）。

1.2 方法

1.2.1 盐酸氨溴索注射液中不溶性微粒样品的制备注射剂中不溶性微粒混悬液按照以下方法制备：4厂家的盐酸氨溴索注射液（对于注射用盐酸氨溴索先采用灭菌用注射用水稀释成15 mg/2 ml），使用0.2 µm孔径滤膜过滤，滤膜上的残留物用0.9%氯化钠注射液冲洗定容。

1.2.2 动物分组、给药及组织样品处理按随机数字表法将Balb/c小鼠分为9组，每组10只，雌雄各半，分别为正常对照组和4种制剂给药组，每个制剂又分为高剂量组（盐酸氨溴索给药剂量为40 mg/kg）和低剂量组（盐酸氨溴索给药剂量10 mg/kg）。A制剂高、低剂量组分别用A-H和A-L表示；B制剂高、低剂量组分别用B-H和B-L表示；C制剂高、低剂量组分别用C-H和C-L表示；D制剂高低剂量组分别用D-H和D-L表示；0.9%氯化钠注射液组用NS表示。给药组小鼠尾静脉分别注射对应剂量盐酸氨溴索不溶性微粒混悬液，连续给药6 d；正常对照组每天给予0.2 ml NS，连续给药6 d。治疗结束后，采集小鼠眼底静脉血，离心，收集血清，-80 ℃储存；麻醉后处死小鼠取其右肺上叶一部分置于10%福尔马林溶液中，剩余冻存。

1.2.3 血清和肺匀浆中NO水平测定[4-5]将Griess试剂的A、B液各取3 ml于10 ml离心管内，混合均匀。取40 μl待测上清液加入酶标条内，再在各待测样品中加入10 μl三蒸水，最后加入50 μl Griess试剂A、B混合液，于震板仪上震荡10 min，于540 nm处检测OD值，换算为NO浓度。

1.2.4 血清和肺匀浆中SOD与MDA水平测定按照试剂盒使用说明书，SOD采用氧化酶法检测，MDA采用TBA法测定。

1.2.5 组织形态学观察制备肺组织、尾静脉组织切片，采用HE染色观察其组织形态学变化，并观察肺组织中白细胞、肥大细胞和巨噬细胞聚集情况。

1.3 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中相关炎症指标的测定

2.1.1 对血清中NO水平的影响A制剂低剂量组对小鼠血清NO水平没有显著性影响（P＞0.05），而其他各组与对照组相比NO水平均明显降低，且呈一定剂量依赖关系，见图1。

图1 盐酸氨溴索注射剂中不溶性微粒对NO的影响(n=10)

2.1.2 对血清中MDA和SOD水平的影响各制剂高剂量组小鼠血清MDA水平均明显高于对照组，尤其是D制剂高剂量组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2；各组中除A制剂和B制剂低剂量组外，其余制剂组小鼠血清SOD水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图2 注射剂中不溶性微粒对血清中MDA的影响(n=10)

2.2 肺组织匀浆中MDA和SOD炎症指标的测定B、C制剂高剂量组和D制剂低高剂量组小鼠肺组织中MDA水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4；D制剂高、低剂量组小鼠肺组织中SOD水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而其他各组与对照组相比差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图5。

图3 注射剂中不溶性微粒对血清中SOD活性的影响(n=10)

图4 注射剂中不溶性微粒对肺中MDA的影响(n=10)

图5 注射剂中不溶性微粒对肺中SOD活性的影响(n=10)

2.3 组织形态学观察

2.3.1 对肺组织病理学的影响高剂量条件下各制剂小粒径不溶性微粒对肺组织形态学观察结果见图6。

图6 盐酸氨溴索注射剂高剂量组中小粒径不溶性微粒对肺组织的影响

肺组织切片结果表明：不同盐酸氨溴索注射剂中小粒径不溶性微粒对肺部组织形态学产生不同程度的影响。A制剂组观察到小鼠细支气管和血管正常，肺泡壁有轻微增厚；B制剂组可见轻微的肺泡壁增厚、肺泡腔内红染的渗出液和肺泡隔断裂；C和D制剂组观察到不同程度的肺泡壁增厚、肺泡腔内见炎性渗出物和肺泡腔的缩小。

2.3.2 对尾静脉组织病理学的影响A制剂组小鼠尾静脉血管周围纤维组织轻微至轻度损伤，其他三种制剂表现为不同程度的整个或部分血管壁结构紊乱，内皮细胞脱落，血管壁平滑肌纤维、弹性纤维及疏松结缔组织等正常结构消失呈均质红染，伴有混合型炎性细胞轻微浸润。见图7。

图7 盐酸氨溴索注射剂高剂量组中小粒径不溶性微粒对尾静脉组织的影响

3 讨论

3.1 4种盐酸氨溴索注射剂中小粒径不溶性微粒NO影响结果表明，小粒径不溶性微粒能够降低NO对机体的保护作用从而对机体造成一定程度的损伤，并且这种影响程度与注射剂中不溶性微粒数量呈依赖关系，制剂间存在明显差异性。血清和肺匀浆中SOD和MDA水平变化，结合肺部组织切片的形态学观察结果表明，注射液中小粒径不溶性微粒在一定程度上可引起氧化应激损伤，这可能是造成进一步组织器官损伤的原因之一。各制剂组对炎症相关指标的影响程度具有明显差异性，从各注射剂不溶性微粒的测定结果提示，小粒径不溶性微粒数量是影响炎性因子释放和肺组织损伤的关键性因素[3]。不溶性微粒的组成成分是否影响炎症指标的差异性，需要进一步分析微粒主要成分和开展相关动物实验研究。

3.2 炎性因子水平增高与氧化应激密切相关过高的氧自由基水平可引起脂质过氧化，导致局部组织细胞损伤和释放炎性介质，启动炎症级联放大反应，加速细胞损伤，形成恶性循环[6-7]。本研究中，注射剂中不溶性微粒导致氧化应激损伤增强可能是诱发炎症相关指标改变的主要原因。研究中评价的仅是注射剂中去除药物的小粒径不溶性微粒对炎症相关指标的影响，对于注射剂中治疗药物尤其是具有抗炎抗氧化活性的药物是否会降低不溶性微粒对炎症相关指标和临床发生不良反应的影响，需要进一步开展动物实验和临床研究评价。

临床静脉给药发生静脉炎约70%与注射剂中不溶性颗粒有关[8-10]，通过本研究中尾静脉组织切片结果表明，注射剂中小粒径不溶性微粒在一定程度上可促使静脉炎产生，并加重其损伤程度。

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The effect of the small size particle matters on the related indexes of inflammation

Qian Jianghui Zhang Xiulei Chen Qinyue Sha Xianyi

Objective To evaluate the effect of the small size particular matter from four kinds of ambroxol hydrochloride injections on mice inflammatory index.MethodsComparison of 4 different dosage under water insoluble particles after intravenous administration of nitric oxide in serum and lung tissue in mice(NO),malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) levels of influence;comparison of different preparations of high dose containing insoluble particles on lung tissue and the effect of tail vein structure in mice.ResultsPreparation of A low dose group has no significant influence on serum NO level(P＞0.05),while other groups compared with the control group NO level was significantly reduced,and in a dose-dependent manner;the preparation of high dose group serum MDA levels were significantly higher than the control group,especially the preparation of D high dose group.The differences were statistically significant(P＜0.05);each group except A preparation and formulation of B low dose group,the preparation group serum SOD levels were significantly lower than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);B,C preparation in high dose group and low dose group D preparation of mouse lung in the level of MDA was significantly higher than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the level of SOD D preparation of high and low dose of lung tissue in mice were significantly lower than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05),There was no significant difference between the other groups and the control group(P＞0.05).ConclusionThe small diameter particular matter of ambroxol hydrochloride injections had different effects on the related indexes of inflammation.

Ambroxol hydrochloride;Injections;Particular matter;Inflammation;Quality evaluation

R944

A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.12.004

复旦大学，上海 201203

钱江辉（1991-），硕士研究生。研究方向：药物新剂型与新制剂

沙先谊（1976-），博士，副教授。研究方向：药物新剂型与新制剂。E-mail：shaxy@fudan.edu.cn