毛竹生长素响应因子基因家族的鉴定及其在竹笋发育中的表达

陈 磊，李晨曦，江 涛，杨兆河，黄志明，苏 军，刘伯斌

(1.福建农林大学林学院；2.福建农林大学基础林学与蛋白组学研究中心，福建福州350002)

毛竹生长素响应因子基因家族的鉴定及其在竹笋发育中的表达

陈 磊1，李晨曦1，江 涛1，杨兆河1，黄志明1，苏 军2，刘伯斌1

(1.福建农林大学林学院；2.福建农林大学基础林学与蛋白组学研究中心，福建福州350002)

以已知拟南芥和水稻生长素响应因子(ARF)蛋白质序列对毛竹基因组数据库进行比对分析显示，毛竹基因组编码39个ARF转录因子；通过生物信息学软件对毛竹ARF基因家族进行分析显示，毛竹ARF基因家族具有进化上的保守性；采用RT-PCR技术研究毛竹竹笋形成过程中ARF基因家族的动态变化，结果显示，在竹笋形成过程中ARF18和11-2基因分别在笋芽萌动和笋体形成过程中发挥调控作用，而ARF6-2基因参与竹笋发育的各个阶段.

毛竹；竹笋发育；生长素响应因子；表达分析

毛竹是地球上生长最快的物种之一，具有重要的经济价值.毛竹的发育可以分为两个阶段:第一阶段为地下发育阶段，即笋芽萌动，逐渐膨大成冬笋的过程[1]；第二阶段为后期的快速生长阶段，即在生长季节已经发育完成的竹笋通过节间的扩张急速生长[2].

生长素被认为是竹笋急速生长的信号分子之一，在快速生长期笋体生长素含量陡然增高，且与竹笋的生长速率呈正相关[3－4].在生长素信号途径中，生长素响应因子(auxin response factor，ARF)和生长素响应元件相结合，直接调控下游基因的表达.在不同组织器官的发育过程中，ARF蛋白是生长素信号通路中的关键转录因子.但生长素信号在竹笋发育过程中如何发挥其功能尚不清楚，研究生长素调控竹笋发育对成竹产量和竹林经营的可持续发展具有重要意义.

本试验首先利用生物信息学方法分析毛竹ARF基因家族，然后通过定量PCR的方法分析毛竹ARF基因家族在毛竹地下发育阶段的动态变化以及对生长素的响应，初步探讨竹笋发育过程中的分子机理，旨在为挖掘速生相关的基因以及林木的速生提供优良的外源基因奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料取自福建农林大学百竹园内科研用毛竹(Phyllostachys heterocyclacv.Pubescens).取其新鲜笋芽(休眠芽、萌发芽、竹笋)置液氮速冻，于－80℃保存备用.毛竹叶片取自福建农林大学林学中心人工气候室.

1.2 方法

1.2.1 毛竹ARF基因家族的鉴定 根据已经鉴定的23个拟南芥[5]和25个水稻[6]ARF蛋白质序列，利用BlastP程序(http://www.rosaceae.org/tools/ncbi_blast)检索毛竹基因组数据库(http://www.bamboogdb. org/page/manual.jsp).通过Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线软件分析毛竹ARF转录因子家族保守结构域.

1.2.2 毛竹ARF基因家族进化的分析 使用ClustalX2软件将毛竹ARF转录因子进行序列比对分析，利用MEGA 6.0软件的最大相似法对毛竹ARF氨基酸序列进行进化分析；同时，引入23个拟南芥和25个水稻ARF蛋白质序列对毛竹ARF家族进行亚组分组.

1.2.3 毛竹ARF基因家族在笋芽(休眠芽、萌发芽)中表达的分析 使用RNeasy PlantMini KitRNA提取试剂盒(德国凯杰有限公司)提取毛竹笋芽(休眠芽、萌发芽)总RNA；每个样品取1.0 μg RNA，使用PrimeScriptTM Reagent Kit试剂盒(宝生物工程有限公司)合成cDNA第一链.定量PCR的引物使用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)在非保守区设计，退火温度为58～60℃，扩增片段长度为150～260 bp.实时荧光定量PCR根据GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒(美国普洛麦格公司)和QuantStudio 6 Flex PCR仪的使用说明进行操作.以TIP41(GenBank登录号:242384689)[7]作为内参基因.一组4次重复进行操作.所有试验重复3次，得到相似的试验结果.数据采用2－△△CT的方法进行相对定量分析.

1.2.4 外源生长素处理后毛竹叶片ARF基因家族表达的分析 将毛竹叶片置于含有1.0 μmol·L－1IAA的B5培养基中浸没2 h，将处理后的叶片置液氮中速冻，研磨提取叶片总RNA并反转合成cDNA.每个基因的qPCR反应均为4次重复(反应方法见“1.2.3”).

2 结果与分析

2.1 毛竹ARF基因家族的鉴定

为了系统鉴定毛竹基因组编码的ARF基因家族，采用已知的23个拟南芥和25个水稻ARF基因家族氨基酸序列分别检索毛竹基因组数据库，得到48个类似毛竹ARF基因序列.进一步对候选基因的DBD和ARF保守结构域进行分析，最终确定39个毛竹ARF基因(图1).毛竹ARF基因家族成员的个数与已经发表的玉米(31个)[8]、杨树(39个)[9]相近，其氨基酸全长含192～1 501个氨基酸残基，分子质量为21～166 ku.

2.2 毛竹ARF基因家族进化分析

为了分析毛竹ARF基因家族与拟南芥、水稻ARF基因家族之间的同源关系，基于拟南芥、水稻和毛竹ARF基因家族的氨基酸序列构建毛竹ARF基因家族进化树(图1).由于毛竹和水稻同属禾本科，亲缘关系较近，故根据与水稻ARF基因的对应关系对毛竹ARF基因进行命名和分组[6](图1).结果显示，毛竹ARF基因家族成员可分为4组:组Ⅰ(类拟南芥ARF3/4)、组Ⅱ(类拟南芥ARF10/16/17)、组Ⅲ(类拟南芥ARF5/7)和组Ⅳ(类拟南芥ARF1/2).其中，组Ⅰ包含毛竹ARF2、3-1、3-2、14和15基因；组Ⅱ包含毛竹ARF8-1、8-1、10、13-1、13-2、18、22-1和22-2基因；组Ⅲ包含毛竹ARF5-1、5-2、6-1、6-2、11-1、11-2、11-3、16/19、17-1、17-2、19-1、19-2、21-1、21-2和25基因；组Ⅳ包含毛竹ARF1-1、1-2、4-1、4-2、7-1、7-2、7/9、9、23、24-1和24-2基因；并且每个毛竹的ARF基因有对应的水稻或者拟南芥的同源基因(图1).此外，39个毛竹ARF基因家族中存在13对姐妹对，分别为ARF1-1、ARF1-2基因；ARF3-1、ARF3-2基因；ARF4-1、ARF4-2基因；ARF5-1、ARF5-2基因；ARF6-1、ARF6-2基因；ARF7-1、ARF7-2基因；ARF11-1、ARF11-基因2；ARF13-1、ARF13-2基因；ARF17-1、ARF17-2基因；ARF19-1、ARF19-2基因；ARF21-1、ARF21-2基因；ARF22-1、ARF22-2基因；ARF24-1、ARF24-2基因.这表明毛竹ARF基因家族有进化上的保守性.

2.3 ARF基因家族在毛竹地下部分发育期的动态变化

在竹笋发育过程中分生组织由休眠状态转变为活跃状态，并且完成笋体的形态建成[10].本试验分析毛竹ARF基因家族在此过程中的动态变化(图2)发现:毛竹ARF13-2和18基因在休眠芽转变为萌发芽过程高水平转录，表明它们参与了休眠芽的转变；ARF1-1、2、3-2、8-2、11-1、11-2、11-3、14、16/19、19-1、22-1、22-2和23基因在竹笋发育阶段才高度表达，表明它们在竹笋的形态建成发挥作用，其中的ARF11-2、22-2和23基因表达上调超过10倍，而ARF11-2基因表达上调超过20倍，ARF11-2基因有可能在笋体发育中发挥主要的功能，其他ARF转录因子发挥协同作用；ARF6-2、15、21-2、24-1、24-2和25基因的转录水平在休眠芽萌动直至笋体形成的过程中逐步上调且超过5倍，这表明它们在整个笋体的发育中发挥功能.与此相反，毛竹ARF1-2、3-2、5-2、6-1和19-1基因在笋体的发育阶段下调5倍，有可能这些ARF基因负调控了竹笋的发育过程.毛竹ARF5-1和7-2基因在休眠芽转变和笋体发育特异下调，可能这两个基因特异负调控休眠芽和笋体的发育.除此之外，毛竹ARF3-1、7-1、7/9、9、10和17-2基因在休眠芽、萌发芽和竹笋中的表达基本保持稳定；ARF4-2、8-1、13-1、17-1和21-1基因在休眠芽、萌发芽和竹笋中均没有检测到表达.

2.4 外源生长素处理后毛竹叶片ARF基因家族的表达

竹笋的发育与生长素紧密联系[3－4]，为了检测在竹笋发育的过程中ARF基因家族的表达是否受到生长素的调控，对毛竹叶片进行生长素处理.结果(图3)显示，IAA处理2 h后，毛竹ARF1-1、1-2、4-1、5-1、6-1、7-2、7/9、8-1、13-1、13-2、17-1、17-2、19-1、19-2、21-2、23、24-1、24-2和25基因表达量下调；而ARF3-1、10、11-2、16/19和22-1基因表达量上调；处理前后表达量几乎不变的是ARF2、3-2、5-2、6-2、7-1、9、11-1、11-3、15、18和22-2基因；此外，ARF4-2、8-2、14和21-1未能检测到表达.这表明大部分毛竹ARF基因的转录水平受生长素的调控.

3 讨论

毛竹ARF基因家族具有保守的进化模式.本试验通过生物信息学的方法鉴定出39个毛竹ARF基因.基于拟南芥和水稻ARF基因家族的进化关系发现:每个毛竹ARF基因至少有一个水稻或者拟南芥的同源基因；同时，毛竹ARF基因家族含有13对姊妹对，暗示毛竹ARF基因家族通过基因复制的方式进行扩张[11].在基因结构上，毛竹ARF基因家族的基因结构不同于水稻和拟南芥的同源基因，姊妹对之间也存在差异，有可能是全基因组复制时产生的删除或者插入造成的.

毛竹笋芽萌动和竹笋形成的过程中受到ARF转录因子的协同调控.在休眠芽转变为活跃状态的过程中，毛竹ARF13-2和18基因的转录水平分别上调16和35倍(图2A).其中，毛竹ARF18基因在拟南芥中的同源基因ARF10在种子萌发中表达，在分生组织从休眠态到活跃态中发挥关键的调控作用[12].这表明了毛竹ARF18基因可能是休眠芽转变为活跃态时主要的ARF基因.在竹笋形成的过程中，ARF11-2、22-2和23基因的表达量上调超过10倍(图2B)，其中，ARF11-2基因表达上调超过20倍(图2B)，并且其转录水平受到生长素的调控(图3B).由于在竹笋形成的过程中，内源生长素含量也逐步增加[3]，暗示着ARF11-2基因正反馈调节笋体的形成.毛竹ARF11-2基因在拟南芥中的同源基因ARF5参与胚轴的形成和维管组织的发育[13－14]，而笋体的形成阶段也是维管组织快速发育时期，这表明ARF11-2基因在竹笋形成中可能正反馈调节毛竹的形态建成及调控维管组织发育.除此之外，ARF6-2基因在休眠芽转变活跃态和笋体发育中表达量逐步上调，在竹笋形成期上调超过30倍，拟南芥中的同源基因ARF6/8主要参与营养生长期间的生长发育过程[15]，ARF6-2基因有可能在竹笋发育的各个阶段都发挥着关键的调控作用.与表达量上升的转录因子相反，部分毛竹ARF基因表达量下调.如ARF7-2基因在竹笋形成期间表达量下调，拟南芥的同源基因ARF1为细胞伸长的抑制因子[16]，而竹笋形成期间是细胞快速伸长的过程，这表明了毛竹ARF7-2基因主要发挥了生长抑制的作用.因此，在竹笋发育的过程中毛竹ARF转录因子协同发挥功能.

本试验对毛竹ARF基因家族进化进行研究，结果表明，毛竹ARF基因家族由39个成员构成，具有进化上的保守性.进一步对竹笋发育期间的表达模式进行分析，发现毛竹ARF18、11-2和6-2基因是竹笋发育各个阶段的关键ARF转录因子，且在同一发育阶段，关键转录因子协同其他ARF转录因子调控竹笋的生长发育和形态建成.

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(责任编辑:施晓棠)

Genome-wide identification and expression analysis of auxin response factor gene family in Phyllostachys heterocycla cv.Pubescens

CHEN Lei1，LI Chenxi1，JIANG Tao1，YANG Zhaohe1，HUANG Zhiming1，SU Jun2，LIU Bobin1
(1.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University；2.Basic Forestry and Proteomics Center，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)

To investigate the role of auxin response factor(ARF)in regulating shoot development of moso bamboo，39PhARFgenes from moso bamboo genome were identified via BlastP analysis.Bioinformation analysis revealed thatPhARFgenes were conservative among species.Dynamic expression pattern ofPhARFfamily was further examined by RT-PCR during young bamboo development process.The results showed that PhARF18 and 11-2 maybe were the main ARF transcription factors in bud germination and young bamboo formation stage，respectively，with PhARF6-2 making difference in both stages.

Phyllostachys heterocyclacv.Pubescens；shoot development；auxin response factor；expression analysis

S718.46

:A

:1671-5470(2016)06-0662-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.06.009

2016－04－12

:2016－05－30

国家自然科学基金——青年科学基金资助项目(31500548).

陈磊(1988－)，男，硕士研究生.研究方向:植物生长发育与分子机制.Email:475215185＠qq.com.通讯作者刘伯斌(1983－)，男，讲师.研究方向:林木分子生物学.Email:163liubobin0377＠163.com.