哌醋甲酯对ADHD动物模型SHR大鼠前额叶皮质层细胞凋亡的影响

阎 樱，王亚萍

(1.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西 西安710004，2.西安市中心医院儿童保健科，陕西西安710003)



哌醋甲酯对ADHD动物模型SHR大鼠前额叶皮质层细胞凋亡的影响

阎 樱1,2，王亚萍1

(1.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西 西安710004，2.西安市中心医院儿童保健科，陕西西安710003)

目的 本研究以自发性高血压大鼠(SHR)作为注意缺陷多动障碍(ADHD)动物模型，探讨ADHD动物模型SHR大鼠中是否存在前额叶皮质层细胞凋亡现象，以及哌醋甲酯能否影响大鼠前额叶皮质层细胞的凋亡。方法 将SD大鼠作为对照组，SHR大鼠分为两组，每组6只，分别为SHR组和哌醋甲酯组。哌醋甲酯组给予哌醋甲酯(2mg/kg)连续灌胃14天，1次/日，对照组、SHR组给予等体积0.9%氯化钠注射液连续灌胃14天，1次/日，取脑，制作石蜡切片，用TUNEL染色观察前额叶皮质层细胞凋亡情况。结果 SHR组前额叶皮质层细胞凋亡率(17.23±0.61%)较对照组(2.74±0.24%)显著增高(F=-13.902，P<0.05)；哌醋甲酯组前额叶皮质层细胞凋亡率(7.82±0.53%)较未经药物干预的SHR组显著减少(F=8.87，P<0.05)，但仍然高于对照组(F=-9.048，P<0.05)。结论 ADHD动物模型SHR大鼠前额叶皮质层细胞存在凋亡增高现象，哌醋甲酯可以在一定程度上改善ADHD前额叶皮质层细胞的凋亡。

注意缺陷多动障碍；哌醋甲酯；大鼠前额叶皮质层细胞； 凋亡；原位末端转移酶标记

注意缺陷多动障碍(ADHD)是儿童及青少年常见的神经发育障碍，主要表现为注意力集中困难、活动过度和冲动行为的症状。最新的Meta分析显示其全球发病率约为3.4%(95%CI:2.6～4.5)[1]。结构像磁共振发现，ADHD儿童的特定脑区比正常儿童体积小，包括前额叶、尾状核、小脑半球和蚓体等[2]。中枢兴奋剂哌醋甲酯(methylphenidate，MPH)是ADHD的一线治疗药物，它能明显提高患者的注意力及改善多动，但其具体治疗机制不详，多数学者认为其与多种中枢神经递质有关，如多巴胺、5-羟色胺、胆碱等[3]。本研究期望发现ADHD患儿脑体积的减少是否与前额叶皮质层细胞凋亡的因素有关；还想要了解对于用哌醋甲酯治疗有效的患儿，其药物的主要机制之一是否为减少前额叶皮质层细胞凋亡。自发性高血压大鼠(SHR)有很多特点类似临床上ADHD患者的表现，被认为是迄今最理想的ADHD动物模型。本研究以ADHD动物模型SHR大鼠为研究对象，探讨ADHD的发病机制是否有前额叶皮质层细胞凋亡因素的参与，哌醋甲酯对于ADHD作用机制是否存在影响前额叶皮质层细胞凋亡的途径。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

三周龄SHR大鼠12只购自北京维通利华实验动物技术有限公司、三周龄SD(Sprague-Dawley)大鼠6只，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，雌雄合笼在层流架带鼠盒内饲养(符合SPF标准)。

1.1.2药品和试剂

0.9%氯化钠注射液、哌醋甲酯缓释片购自西安交通大学第二附属医院西药房。原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1动物实验过程

将SD大鼠6只作为对照组(A组)，按照随机分组原则，SHR大鼠分为两组，每组6只，分别为SHR组(B组)和哌醋甲酯组(C组)。实验期间C组给予哌醋甲酯(2mg/kg)连续灌胃14天，1次/日；A、B组给予等体积0.9%氯化钠注射液连续灌胃14天，1次/日。整个实验过程自由饮水、进食，自然昼夜节律光照。

1.2.2脑标本采集

大鼠麻醉后心脏灌注固定，开颅取脑(前段约4mm作为额叶)，放入10%甲醛溶液中固定，制作石蜡切片，用于TUNEL染色观察前额叶皮质层细胞凋亡情况。

1.2.3 TUNEL技术检测大鼠前额叶皮质层细胞凋亡

按照试剂盒说明书进行脱蜡、水化、固定、细胞通透、固定、平衡、制备TUNEL反应混合液、标记反应、终止反应、封闭POD、酶标反应、DAB显色(避光)、用苏木素复染、中性树胶封片等步骤后，倒置显微镜下观察前额叶皮质层细胞TUNEL的阳性表达并照相。

1.2.4凋亡细胞计数

光镜下观察，选择切片中最有代表性的视野，每张切片连续随机观察5个非重叠视野(10×10)，采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统进行阳性细胞计数，计算阳性率=阳性细胞数/观察细胞数×100%。

1.3统计学方法

对于连续性的变量，数据以均数±标准差表示。采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，使用单因素方差分析进行组间差异比较，检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

对照组前额叶皮质镜下偶见阳性反应细胞，较多表现为核着色浅蓝，细胞疏散且界限较为不清的TUNEL阴性细胞(见图1A)，阳性率2.74±0.24%(见表1、图2)。SHR组可见大量TUNEL阳性反应细胞即凋亡细胞，胞核固缩浓染，呈深褐色，胞体缩小，形状不规则(见图1B)，阳性率17.23±0.61%(见表1、图2)。与对照组相比，前额叶皮质层凋亡细胞阳性率显著增高，有统计学差异(P<0.05)，见表1、图2。哌醋甲酯组光镜下可见少量凋亡细胞(见图 1C)。阳性率7.82±0.53%，见表1，图2。与SHR组相比，凋亡细胞阳性率显著降低(P<0.05)，但仍然高于正常对照组(P<0.05)，见表1、图2。

组别样本数(只)凋亡细胞率对照组6(2．74±0．24)SHR组6(17．23±0．61)ac哌醋甲酯组6(7．82±0．53)bcF123．73P0．00

注：SHR组vs对照组，F=-13.902，aP<0.05；哌醋甲酯组vs对照组，F=-9.048，bP<0.05；哌醋甲酯组vs SHR组，F=8.87，cP<0.05。

注：A表示对照组；B表示SHR组；C表示哌醋甲酯组。

图1 TUNEL技术检测各组大鼠前额叶皮质层凋亡细胞(100倍)。

Fig.1 PFC cells apoptosis of rats detected by TUNEL in different groups (100 fold)

注：**表示组间有显著性差异，P<0.05。

图 2 各组大鼠前额叶皮质层细胞凋亡率比较

Fig.2 Comparison of apoptosis rate of PFC cells of rats among different groups

3讨论

3.1注意缺陷多动障碍的发病机制的研究现况

注意缺陷多动障碍(ADHD)是儿童最常见的心理行为疾患之一，患病率通常为3%～5%，男女发病比例为2～9:1。患儿通常具有如下临床特征：注意力易分散且与年龄不相称，注意广度缩小，不分场合的过度活动以及情绪冲动等；常合并有其他行为问题，如学习障碍、品行障碍、情绪障碍、抽动障碍等。

近年来儿童ADHD发病率有逐渐上升趋势，但其发病机制仍不清楚。目前多认为ADHD是一种多因子参与的复杂疾病，其中遗传因素、神经影像学改变、家庭社会环境因素以及环境毒素等备受关注[4]。首先在遗传因素方面，这些候选基因主要集中在多巴胺能通路、5-羟色胺相关通路以及去甲肾上腺能通路的相关基因。而多巴胺能系统因其在运动控制、认知功能中有重要作用而受到广泛关注。在比较热点的多巴胺能通路候选基因中DRD4及DAT1是研究最广泛的 ADHD候选基因。其次，近年来随着影像学的发展，尤其是功能核磁共振的出现和发展，发现ADHD儿童脑结构及功能存在异常改变，这为ADHD是一种儿童神经发育异常性疾病提供了客观可靠的依据，同时这些改变在ADHD的发病机制中起着至关重要的作用。在功能磁共振成像(fMRI)的研究中发现左侧下前额叶皮质/岛叶，脑及左侧顶下小叶皮质活动下降被认为与ADHD患儿较差的时间控制相关[5]。还有研究表明在抚养机构成长儿童中，其ADHD 发病率高于社区抚养儿童，且抚养机构抚养的儿童与社区抚养的儿童相比存在广泛的大脑皮层厚度减少(包括前额叶、顶叶及颞叶)，表明大脑皮层厚度的减少可以解释抚养机构抚养儿童ADHD症状明显增高的原因[6]。这种现象与儿童后期和青少年阶段的ADHD患者显示出皮层厚度的发育迟缓程度与症状的严重性显著相关有一致性存在，而这种异常可能是凋亡相关基因及蛋白高表达的因素导致。

3.2前额叶皮质层细胞凋亡也许参与了注意缺陷多动障碍的发病机制

随着影像学的发展，可以为ADHD的发病机理提供新证据。研究发现ADHD儿童异常的脑区主要位于前额叶、枕叶、小脑。例如对ADHD儿童脑结构的磁共振成像研究中发现，ADHD儿童的右前额叶、右纹状体、左顶叶的体积减小，而右枕叶的体积增大，左后外侧脑室扩张。已明确额叶纹状体回路在运动及注意力控制中起着重要作用。有研究在任务态fMRI常发现ADHD患儿的额叶及额纹状体区存在活动减退(血流量下降)的脑区，如初级运动皮层与双侧额下回、右侧缘上回、角脑回、杏仁核、豆状核、苍白球之间的功能联系活动减少，从而提示ADHD患儿在运动通路中存在损害[4]。还有研究提示ADHD组前额叶扣带回功能减弱，所以不能有效的监控目标，从而导致ADHD患者意识活动无法轻松自如地持续快速地连续运行，使得注意力分散和多动。也有研究发现双侧前额叶间连接强度高，使神经纤维的传递不能有序进行，皮层活动有效性降低，从而表现出注意力障碍等[7]。上述研究均提示ADHD的发病机制与前额叶的结构功能异常密切相关。本研究结果显示SHR大鼠的前额叶皮质层凋亡细胞阳性率明显高于对照组大鼠。另外，动物模型的行为学研究发现，SHR大鼠与对照组大鼠之间存在记忆能力的差别，SHR大鼠表现出明显的记忆障碍，而学习能力无显著差异[8]。前额叶皮质是与记忆密切相关的脑部结构，它是负责工作记忆的重要脑区。有研究发现额叶两侧功能连接强度增加，使短暂记忆过程繁复，记忆时间延长，故ADHD儿童常表现工作记忆障碍[7]。因此认为ADHD的记忆障碍可能与前额叶皮质层细胞的凋亡有关。

3.3哌醋甲酯改善ADHD的学习记忆可能与影响脑细胞凋亡的途径有关

临床上哌醋甲酯是治疗ADHD的常用药，动物行为学研究发现，哌醋甲酯能明显改善SHR大鼠多动、冲动行为及记忆障碍，表现为在Morris水迷宫空间探索实验中接受哌醋甲酯干预的大鼠在原平台象限停留时间的百分比增加且穿越原平台的次数也增多。另有研究显示它对课堂学习任务的完成及社会功能均有正性的作用。还有影像显示中枢兴奋性药物能够使ADHD患者皮层及皮层下组织，丘脑及白质发育向正常化发展。本研究结果显示哌醋甲酯干预的SHR大鼠前额叶皮质层凋亡细胞较未经药物干预的SHR大鼠显著降低，表明精神兴奋药促使脑向正常化发展，说明哌醋甲酯改善ADHD的临床症状(尤其是发病机制不明的学习记忆方面)可能存在前额叶皮质层细胞凋亡途径的参与。这可能对于治疗ADHD新药的研发提供新的方向。

总之，ADHD患者脑结构异常、发育障碍以及症状的存在可能与前额叶皮质层细胞凋亡有关，哌醋甲酯促使脑向正常化发展，改善ADHD临床症状可能通过影响前额叶皮质层细胞凋亡的途径。我们的研究首次从细胞凋亡方面对ADHD 发病机制进行阐明，这是本课题的创新之处，然而哌醋甲酯影响凋亡通路的具体机制还需要进一步研究探讨。

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[3]Cortese S.the neurobiology and genetics of Attention-Deficit/Hyper-activity Disorder(ADHD):what every clinician should know[J].Eur J Paediatr Neurol,2012,16(5):422-433.

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[专业责任编辑：帖利军]

Effect of methylphenidate on prefrontal cortex (PFC) cells apoptosis in SHR of ADHD model

YAN Ying1,2, WANG Ya-ping1

(1.SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710004,China;2.DepartmentofChildHealthcare,Xi’anCentralHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To investigate whether apoptosis of prefrontal cortex (PFC) cells exists in spontaneous hypertension rat (SHR) taken as animal model of attention deficit hyperactive disorder (ADHD) and the effect of methylphenidate on PFC cells apoptosis in SHR. Methods SD rats were used as control group, and 12 SHRs were equally divided into two groups including SHR group and methylphenidate group. Methylphenidate group was fed with methylphenidate (2mg/kg) once a day for 14 days. Control and SHR groups were fed with the same volume of 0.9%NaCl once a day for 14 days. Brain tissue was made into paraffin sections, and apoptosis of PFC cells was detected by TUNEL staining. Results The apoptosis rate of PFC cells in SHR group (17.23±0.61%) was significantly higher than that in the control group (2.74±0.24%) (F=-13.902,P<0.05). The apoptosis rate of PFC cells in methylphenidate group (7.82±0.53%) was greatly lower than SHR group without intervention (F=8.87,P<0.05), but it was higher than that in the control group (F=-9.048,P<0.05). Conclusion Increase of apoptosis of PFC cells appears in SHR rat as animal model of ADHD. Methylphenidate may reduce apoptosis of PFC cells in some degree. This study provides valuable insights for mechanism of ADHD and the action of methylphenidate in treating ADHD.

attention deficit hyperactivity disorder (ADHD); methylphenidate; prefrontal cortex (PFC) cells; apoptosis; terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)

2016-07-21

阎 樱(1978-)，女，副主任医师，硕士研究生，主要从事儿童保健工作。

王亚萍，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.007

R179

A

1673-5293(2016)12-1450-03