复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠胸主动脉PAI-1、t-PA表达的影响

崔荣岗，田风胜，苏 阳，白海龙，边 云，孟晓峰

复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠胸主动脉PAI-1、t-PA表达的影响

崔荣岗，田风胜，苏 阳，白海龙，边 云，孟晓峰

目的 观察复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠胸主动脉1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)表达的影响，探讨其对纤溶系统的作用。方法 将Wistar大鼠随机分为对照组和糖尿病造模组，造模成功大鼠随机分为模型组、复荣通脉低剂量组(0.7 g/kg)、复荣通脉中剂量组(1.4 g/kg)、复荣通脉高剂量组(2.8 g/kg)，8周后，观察各组大鼠血糖、血脂水平及胸主动脉PAI-1及t-PA免疫组化表达。结果 造模组大鼠血糖较对照组明显升高(P<0.05)；胸主动脉PAI-1表达在各造模组较对照组明显增强(P<0.05)，而在复荣通脉中剂量组、高剂量组表达明显受抑制；胸主动脉t-PA表达在各造模组较对照组明显减弱(P<0.05)，在复荣通脉中剂量组、高剂量组其表达明显增强(P<0.05)。结论 复荣通脉胶囊可抑制PAI-1、促进t-PA在大鼠胸主动脉的表达。

糖尿病；大血管病变；复荣通脉胶囊；1型纤溶酶原激活物抑制剂；组织型纤溶酶原激活物

我国成人糖尿病患病率已升至11.6%[1]，给人们健康造成极大威胁。糖尿病大血管病变发病率居高不下，可导致冠心病、脑卒中、肾功能不全、糖尿病足，严重影响糖尿病病人的生活质量甚至预期寿命。纤溶系统功能失衡是大血管病变的重要发病机制之一，且可导致急性心血管事件的发生。

复荣通脉胶囊是益气活血通络类中药复方制剂，用于糖尿病性周围神经及周围血管病变的治疗，多年临床应用疗效显著。本研究观察复荣通脉胶囊对Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)表达的影响，从而探讨其防治糖尿病大血管病变的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性Wistar大鼠60只(体重200 g±20 g)，由河北省实验动物中心提供[动物合格证编号：1405034，单位许可证号：SCXK(冀)2013-1-003]。每笼4只大鼠，自由饮水，定期添加饲料，室温22 ℃～26 ℃，湿度45%～65%，每日12 h光照维持，昼夜循环。

1.2 实验仪器 电子天平(日本HM-200)、血糖仪(罗康全活力型)、日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11光学显微镜及其照相装置、病理图文分析系统、病理组织漂烘处理仪、德国Eppendorf-5430离心机、日本HM-200电子天平、德国莱卡RM2015石蜡切片机、江苏太仓医用仪器厂DSHZ-300型恒温水浴箱、德国EPPENDORF移液器、日本三洋MDF-382E型超低温冰箱、美国Media Cybernetics公司多功能真彩色细胞图像分析管理。

1.3 实验用药及主要试剂

1.3.1 实验用药 复荣通脉胶囊，主要组方：地龙、全蝎、黄芪、水蛭、玄参、首乌藤、川牛膝、葛根、穿山龙、甘草、当归。由河北省沧州中西医结合医院中药制剂室监制生产，由多种中药粉末组成，每粒胶囊0.5 g，含生药2 g，按比例加入水制成混悬液。批准文号：冀药制字Z20070041，生产批号：140310。

1.3.2 主要试剂 链脲佐菌素(STZ)：美国Sigma公司，批号S0130；PAI-1免疫组化试剂盒，批号：MB0705；t-PA免疫组化试剂盒，批号：MB0705；北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型的建立 60只大鼠，适应性饲养1周。1周后以单纯随机抽样，采用随机数字表法选择10只为正常对照组(NC组)，余50只为造模组。参照文献方法[2]，造模组大鼠禁食12 h后，一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg(STZ临用前用0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液配成浓度为1%、pH=4.2的溶液)；正常组腹腔注射等量枸橼酸钠缓冲液。72 h后尾静脉取血测血糖，血糖值≥16.7 mmol/L确定为糖尿病大鼠模型建立，期间大鼠喂标准饲料。稳定1周后列入观察对象。造模过程中死亡3只，血糖未达标者3只。不成模者弃之不用。

1.4.2 分组与给药方法 造模成功后大鼠随机抽取40只，分为模型组(DM)，复荣通脉胶囊低剂量组(FRL)、复荣通脉胶囊中剂量组(FRM)、复荣通脉胶囊高剂量组(FRH)，每组10只。中药组剂量按人体-大鼠体表面积比值表换算大鼠等效剂量[2]。复荣通脉胶囊低剂量组给予0.7 g/(kg·d)灌胃、复荣通脉胶囊中剂量组给予1.4 g/(kg·d)灌胃、复荣通脉胶囊高剂量治疗组给予2.8 g/(kg·d)灌胃，每日灌胃1次，连续8周。正常组和模型组每日给予同等剂量生理盐水灌胃。实验期间大鼠自由饮水，喂标准饲料，环境温度为22 ℃～26 ℃，实验期间未使用胰岛素和其他降糖药物。

1.4.3 主要观察指标 大鼠精神状态、饮水量、尿量、毛色等一般情况；血糖水平；胸主动脉PAI-1及t-PA表达水平；动脉组织镜下病理形态学改变。

1.4.4 标本的留取 8周后，禁食12 h，大鼠称重。尾静脉取血测血糖。以戊巴比妥80 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主动脉采血，离心分离血清，测血糖。留取胸主动脉，置于4%中性福尔马林溶液中固定，采用免疫组织化学法检测PAI-1、t-PA。

1.4.5 石蜡切片与免疫组化测定 取实验组和对照组新鲜动物组织，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm组织块；用4%多聚甲醛0.1 MPBS，pH7.0～7.6，含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)固定，给予70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇30 min 2次、95%乙醇30 min 2次、100%乙醇30 min 2次、二甲苯透明30 min 2次、55 ℃石蜡中30 min 2次，用铜制模具包埋组织；将厚度3 μm～5μm组织切片附于经多聚赖氨酸附膜置载玻片上，60 ℃烘烤过夜；将切片浸于二甲苯中5 min 2次、100%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、90%乙醇5 min 2次、85%乙醇5 min 2次、75%乙醇5 min 2次、自来水冲洗、PBS冲洗2次；1%甲醇过氧化氢，室温10 min，蒸馏水冲洗1次，0.1 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min；将切片放入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在微波炉内微波辐射10 min；修复液降至室温后，0.1 mol/L PBS冲洗3次各5 min；切片上滴正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩掉多余液体，不洗；切片上滴第一抗体，4 ℃过夜，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；切片上滴生物素化第二抗体(IgG)，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次，每次5 min；使用DAB显色试剂盒1 mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，显色6 min，充分水洗；苏木素复染细胞核1 min，充分水洗、1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝、充分水洗、经70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min 2次、95%乙醇5 min 2次、100%乙醇5 min 2次脱水、二甲苯透明5 min 2次、中性树脂封片；选择实验组及对照组阳性和阴性组织，进行100×和400×的显微照相。

1.4.6 染色结果判定 PAI-1、t-PA的染色阳性表达以细胞质内和(或)细胞膜内出现棕黄色颗粒，强度大于非特异性背景为准，PAI-1、t-PA阳性染色主要分布于动脉平滑肌细胞胞浆内。结果判断采用方差分析法，IHS=A×B，按阳性细胞面积占总细胞面积比例和染色深度进行评分并分级。A为阳性细胞面积分级：0～1%为0级、1%～10%为1级、10%～50%为2级、50%～80%为3级、80%～100%为4级；B为阳性细胞显色强度分级：0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)，本实验以≥2计为阳性。

2 结 果

2.1 实验动物数量分析 纳入实验观察47只：NC组10只，DM组9只，FRL组10只，FRM组9只，FRH组9只，符合统计学原则。

2.2 各组大鼠血糖比较 造模前各组大鼠血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前与NC组比较，DM组及FRL组、FRM组、FRH组大鼠血糖均显著升高(P<0.05)，DM组及FRL组、FRM组、FRH组间血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)。经灌胃治疗8周后，与NC组比较，DM组及FRL组、FRM组、FRH组大鼠血糖，均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；DM组及FRL组、FRM组、FRH组大鼠血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)；NC组、DM组及FRL组、FRM组、FRH组血糖与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠血糖比较 mmol/L

2.3 各组大鼠PAI-1比较 与NC组大鼠动脉中有少量表达比较，DM、FRL、FRM、FRH组大鼠动脉中表达明显增多(P<0.05)。与DM组比较，FRL组表达差异无统计学意义(P>0.05)；FRM组、FRH组表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与FRL组比较，FRM组表达差异无统计学意义(P>0.05)；FRH组表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与FRM组比较，FRH组表达差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2、图1。

表2 各组大鼠PAI-1比较

NC组 DM组 FRL组 FRM组 FRH组

2.4 各组大鼠t-PA比较 与NC组比较，DM组、FRL组、FRM组、FRH组大鼠动脉中t-PA表达明显减少(P<0.05)。与DM组比较，FRL组t-PA表达，差异无统计学意义(P>0.05)；FRM组、FRH组t-PA表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与FRL组比较，FRM组t-PA表达差异无统计学意义(P>0.05)；FRH组t-PA表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。与FRM组比较，FRH组t-PA表达差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图2。

表3 各组大鼠t-PA比较

NC组 DM组 FRL组 FRM组 FRH组

3 讨 论

3.1 纤溶系统异常与动脉粥样硬化 纤溶酶原激活物(t-PA和u-PA)、血栓调节蛋白共同作用是对抗血栓形成关键的生理机制[3]。一旦平衡被打破，就可能导致血栓形成。血管内皮细胞可产生PAI-1。PAI-1是舍平类(serpins)超家族的成员，是t-PA、u-PA主要抑制因子。血浆PAl-1水平在夜间较高、清晨达高峰，故纤溶活性在清晨最低，和缺血所致心血管事件峰值一致[4]。流行病学研究发现，PAI-1水平和活性与胰岛素抵抗关系密切，与胰岛素抵抗标志物水平呈正相关，故推测PAI-1可能是其组成部分[5]。许多研究已证实，冠心病特别是心肌梗死和不稳定型心绞痛病人血浆PAI-1明显增高[6]。有研究比较非糖尿病急性心肌梗死病人与年龄相匹配正常人，发现心肌梗死前病人血浆PAI-1活性增高[7]。研究发现，PAI-1浓度增高可预测稳定型心绞痛病人首次心肌梗死的发生[8]。病理研究发现，临床前期和进展型动脉粥样硬化病灶中有大量纤维蛋白相关肽，它可能通过刺激血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、结合低密度脂蛋白胆固醇及脂蛋白(a)促进斑块的生长[9]。局部纤溶降低减少纤维蛋白的降解与转移，纤维蛋白的长期慢性沉积导致血管不断反复损伤，利于斑块生长，血流动力学改变及存在湍流部位，这可能是动脉粥样硬化发生、进展的一个重要原因。

3.2 祖国医学对糖尿病大血管病变的认识 糖尿病属中医“消渴”范畴，其主要病机是阴虚为本，燥热为标。糖尿病大血管病变属于消渴变证，由消渴日久所致，而血瘀证贯穿糖尿病大血管病变全过程。病人临床上多表现为舌质紫暗、有瘀斑，或舌下静脉曲张，心胸憋闷、刺痛、肢体疼痛、眼底出血等，均属中医血瘀证。消渴日久，燥热耗气伤阴，导致气阴两虚，气虚则运化无力，水液输布、运化失调，化为水湿痰浊，气虚无力推动血行，则血运不畅，加之津血同源，阴虚燥热，津亏液少，则血行淤滞；痰湿瘀血阻于脉络，血行不畅，血脉闭阻则发为此病。瘀血是痰湿在气阴两虚基础上产生的病理产物，可阻碍气机、血行，影响气血运行，加重气阴两虚的程度，进一步导致痰湿、瘀血，加重血脉阻滞的状态[10]。现代研究认为内皮功能损伤的中医病机属血瘀，并且通过活血化瘀的中医药治疗可改善血管内皮细胞的功能和动脉粥样硬化。因此，气阴两虚，瘀血阻滞是糖尿病大血管病变发生、发展的主要机制，益气养阴活血则成为糖尿病大血管病变的基本治疗理论与方法[11]。

3.3 复荣通脉胶囊组方、药理作用、研究进展 复荣通脉胶囊为沧州中西医结合医院院内中药复方制剂，含地龙、全蝎、黄芪、水蛭、玄参、首乌藤、川牛膝、葛根、穿山龙、甘草、当归，有益气活血通络之效。开发之初用于周围血管病变。现代药理对中药研究发现，复荣通脉胶囊组方中大多数药味具有抗凝、抗氧化、降脂、降糖、改善循环的作用。水蛭素是水蛭体内起抗凝作用的主要活性成分，使凝血酶失去裂解纤维蛋白能力，阻止凝血酶催化凝血因子活化[11]，并有报道称水蛭有防止血栓形成和延伸的作用[12]。地龙具有抗氧化、改善循环功能[13]。Wu等[14]研究表明，黄芪多糖有较好对抗氧化损伤和保护血管内皮细胞的功能。太子参具有抗氧化、降糖、降脂[15]的作用。实验发现，牛膝中的牛膝多糖有抗凝作用[16]，牛膝总皂苷有血管舒张作用[17]。葛根是近几年研究较多的中药，证明有降低血糖[18]、抗氧化作用[19]。研究发现，夜交藤对实验性动脉粥样硬化有一定的防治作用[20]。近年研究表明，甘草的有效成分对羟基自由基、超氧阴离子自由基和过氧化氢等均有明显的清除作用及显著的抗脂质过氧化作用；甘草酸能降低胆固醇含量和磷脂质，抑制机体和血管壁炎症反应，防治动脉粥样硬化进展[21]；甘草酸盐可抑制血小板聚集；甘草黄酮类物质可防止低密度脂蛋白发生脂质过氧化反应[22]，由此可见甘草对血管病变有重要作用。贾彩霞等[23]研究复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平及坐骨神经神经生长因子(NGF)表达的影响，证明复荣通脉胶囊具有拮抗氧化应激、促进神经再生作用。王庆凯等[24]研究发现，复荣通脉胶囊可降低可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和可溶性血栓调节蛋白(sTM)浓度，减轻内皮细胞损伤，有助于减少糖尿病大鼠心肌病的发生与发展。于文霞等[25]通过对164例糖尿病性周围血管病变病人进行随机对照研究，发现复荣通脉胶囊可明显改善下肢供血，治疗糖尿病性周围血管病变疗效确切。李倩等[26]报道，复荣通脉胶囊可明显增加肾上腺素致微循环障碍小鼠耳郭微动脉及微静脉管径，加快微血管内红细胞流速，改善小鼠耳郭微循环障碍；可明显减轻实验性大鼠动-静脉旁路血栓形成；即复荣通脉胶囊可改善微循环，预防血栓形成。

综上所述，既往实验及临床研究均提示复荣通脉胶囊对糖尿病大血管病变有明确治疗作用，但其具体作用尚未完全阐明。本研究提示，复荣通脉胶囊对糖代谢无明显影响，可抑制PAI-1、促进t-PA在动脉组织表达，从改善血管内皮舒缩功能、调节纤溶系统角度探讨其抗动脉粥样硬化机制，为复荣通脉胶囊治疗糖尿病周围血管病变提供理论依据。复荣通脉胶囊单药组分可在不同层面发挥抗动脉硬化作用，但作为成药是否有其他抗动脉硬化的机制尚需进一步研究。

[1] Yu X，Wang LM，Jiang H，etal.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA，2013，310(9)：948-958.

[2] 徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法[M].北京：人民卫生出版社，2005：1239-1240.

[3] Rosenberg RD，Aird WC.Vascular-bed-specific hemostasis and hypercoagulable states[J].N Engl J Med，1999，340(20)：1555-1564.

[4] Douglas E，Vaughan MD．Angiotensin，fibrinolysis，and vascular bomeostasis[J]．Am J Cardiol，2001，87(Supp1)：18-24.

[5] Gray RP，Panahloo A，Mohamed-All V，etal.Proinsulin like molecules and plasminogen activator inhibitor type 1(PAI-1) activity in diabetic and non-diabetic subjects with and without myocardial infarction[J].Atherosclerosis，1997，130：171-178.

[6] Zelewski A，Shi Y，Nardone D，etal.Evidence for reduced fibrinolytic activity in unstable angina at rest clinical，biochemical and angiographic correlates[J].Circulation，1991，83：1685-1691.

[7] Bavenholm P，Pmudler A，Silveira A，etal.Relationships of insuin an dintact and split pminsulin to haemostatic function in young men with and without coronary artery disease[J].Thromb Haemost，1995，73：568-575.

[8] Held C，Hjemdahl P，Rehnqvist N，etal.Fibrinolytic variables and cardiovascular prognosis in patients with stable angina pectoris treated with verapamil or Metoprolol：results from the angina prognosis study in stockholm[J].Circulation，1997，95：2380-2386.

[9] Yarmmoto K，Satio H．A pathological role of increased expression of plsminogen activator inhibitor 1 in human or animal disorders[J].Int J Harnatol，1998，68：371-385.

[10] 高泓，谢春光，赵旭，等.糖尿病大血管病变的中医病机分析[J].时珍国医国药，2009，20(6)：1314-1315.

[11] 陈江海.中医对糖尿病大血管病变治疗机制的研究[J].当代医学，2010，16(19)：161-162.

[12] 袁红霞，张莉芹，马瑾.水蛭药用成分及主要药理功效研究进展[J].甘肃医药，2013，32(4)：270-273.

[13] 袁继伟，焦跃军，王晶尧.中药水蛭的药理药效研究[J].中国医疗前沿，2009，4(18)：18.

[14] Wu Y，Shi XS，Wang SS，etal.Protective role of polysaccharide on endothelium cells incuded by atherosclerosis[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2005，9(23)：238-240.

[15] 汪剑飞.太子参药理研究新进展[J].实用药物与临床，2013，16(4)：333-334.

[16] 孔阳，葛妍.牛膝多糖的药理作用概述[J].科技论坛，2011，19：21.

[17] 李兰娥，卞筱泓，许激扬，等.牛膝总皂苷对大鼠离体胸主动脉环舒张作用的机制研究[J].西北药学杂志，2012，27(3)：223-226.

[18] 韩建平.降糖的中药分析[J].中草药，1995，26(3)：163.

[19] 张光成.葛根异丙酮对SOP活性的研究[J].同济医科大学学报，1997，26(5)：319.

[20] 黄树莲.首乌藤降血脂作用的实验研究[J].中草药，1991，22(3)：117.

[21] 傅乃武，刘朝阳，张如意，等.甘草黄酮类和三帖类化合物抗氧化作用的研究[J].中药药理与临床，1994，10(5)：26-29.

[22] Jacob W，Paula B.Antioxidant constituents from licorice roots：isolation，structure elucidation and antioxidative caaity toward LDL oxidation[J].Free Racical Biology Medicine，1997，23(2)：302-309.

[23] 贾彩霞，王元松，迟秀娥，等.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠血清SOD，MDA水平及坐骨神经NGF表达的影响[J].中药实验方剂学杂志，2013，19(1)：276-280.

[24] 王庆凯，王庆利，闫翠环，等.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌微血管内皮的影响[J].中国药业，2014，23(15)：11-13.

[25] 于文霞，田风胜，苏秀海，等.复荣通脉胶囊改善糖尿病性周围血管病变下肢血流临床观察[J].中国现代医药杂志，2007，9(2)：69-71.

[26] 李倩，李宝芬.复荣通脉胶囊主要药效学研究[J].中华中医药杂志，2007，22(5)：316-318.

(本文编辑薛妮)

The Iufluence of Furong Tongmai Capsule on the Expressions of PAI-1 and t-PA in Thoracic Aorta Tissue of Diabetic Rats

Cui Ronggang,Tian Fengsheng,Su Yang,Bai Hailong,Bian Yun,Meng Xiaofeng

Cangzhou Clinical Medical School of Integrated Chinese and Western Medicine,Hebei Medical University,Cangzhou 061001,Hebei,China

Objective To observe the effects of Furong Tongmai capsule (FTC) on the expressions of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) and tissue plasminogen activator (t-PA) in thoracic aorta tissue of diabetic rats,and explore its possible mechanism.Methods Wistar rats were randomly chosen as blank control group and diabetes model group.The diabetic model rats were randomly divided into DM,FTC low-dose group,FTC medium-dose group,FTC high-dose group.Aftet 8 weeks later,we observed the blood sugar and the expression levels of PAI-1,t-PA with immunohistochemical technique.Results The blood sugar of diabetic rats was significantly higher than that in control group.The expression of PAI-1 in thoracic aortic was decreased in FTC medium-dose group and FTC high-dose group.The expression of t-PA in thoracic aortic was increased in FTC medium-dose group and FTC high-dose group.Conclusion FTC could improve the expression of t-PA,inhibit the over-expression of PAI-1 in thoracic aorta tissues of diabetic rats.

diabetic macroangiopathy；Furong Tongmai capsules；plasminogen activator inhibitor-1；tissue plasminogen activator

河北医科大学附属沧州中西医结合临床医学院(河北沧州 061001)，E-mail：cuirgdujx1215@sina.com

引用信息：崔荣岗，田风胜，苏阳，等.复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠胸主动脉PAI-1、t-PA表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14(23)：2762-2766.

R587.1 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.23.013

1672-1349(2016)23-2762-05

2016-02-29)