红景天苷对脑缺血再灌注大鼠炎性细胞因子表达的影响

魏艺聪，洪海棉，应雄，陈建雄，张小琴，洪桂祝

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

红景天苷对脑缺血再灌注大鼠炎性细胞因子表达的影响

魏艺聪，洪海棉，应雄，陈建雄，张小琴，洪桂祝

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的从炎症反应探讨红景天苷减轻脑缺血再灌注继发损伤的早期保护机制。方法健康成年雄性SD大鼠36只，随机分为假手术组、模型对照组、红景天苷给药组3组。通过线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，采用Longa评分法对大鼠神经功能损伤评分，给药24 h后取材，RT-qPCR技术检测大鼠患侧脑组织TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等炎症因子的mRNA表达，Western blot法检测大鼠患侧脑组织iNOS与COX-2蛋白的表达。结果与模型对照组比较，红景天苷给药组能明显降低患侧脑组织TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等炎症因子的mRNA表达（P＜0.01），同时降低iNOS与COX-2蛋白的表达（P＜0.05）。结论红景天苷能够降低脑缺血再灌注模型大鼠患侧脑组织的炎症反应，并抑制iNOS／NO及COX-2／PGE2炎症信号通路有关。

红景天苷；脑缺血再灌注；炎性细胞因子；iNOS／NO；COX-2／PGE2；信号通路

脑缺血再灌注（MCAO）后引起的炎症反应在脑组织损伤过程中起重要作用，大量研究表明：脑缺血再灌注后释放大量炎症信号，促进炎性细胞的聚集和炎性因子的释放，引起脑组织水肿、血脑屏障破坏等，从而加重脑组织的损伤［1］，因此，炎症反应被认为是脑缺血再灌注后脑组织继发性损伤的主要机制之一。有研究表明：iNOS/NO及COX-2/ PGE2信号通路参与TNF-α、IL-6、IL-1β等多种炎症基因的调控，在脑卒中引发的炎症反应中发挥重要作用，并进一步加重神经损伤［2-4］。

红景天苷对羟基苯乙基-β-D葡萄糖苷，是红景天的主要活性成分［5］。红景天是生长于海拔3 500 m以上的天然植物，在我国具有悠久的药用历史。根据《中华人民共和国药典》（2015版），红景天的功能与主治为“益气活血，通脉平喘，用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘”。报道显示其减少疲劳、提高精神等功效被西方国家包括瑞典、法国和德国等国家认可，红景天苷具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等功能［5］。我们曾报道：动物造模后连续6 d红景天苷给药后可显著减少大鼠局灶性脑缺血再灌注大脑的梗死体积和降低脑缺血大鼠神经功能缺损评分，具有显著神经保护作用，而其早期的神经保护作用机制尚不清楚［6-7］。为进一步阐明红景天苷减轻继发性损伤的早期神经保护作用机制，本研究从炎症反应和iNOS/NO及COX-2/PGE2信号通路研究了红景天苷减轻脑缺血再灌注继发损伤的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物健康成年雄性SPF级SD大鼠36只，体质量（280±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司（合格证号：2007000509960，许可证号：SCXK（沪）2007-0005），饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。

1.2 主要试剂与受试药物总RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司，批号：74106）；反转录试剂盒RT试剂盒（美国Fermentas公司，批号：K1622）；荧光定量PCR Master Mix（美国Applied Biosystems公司，批号：R110 22），PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，TNF-α基因引物：上游序列5'-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3'；下游序列5'-GCTACGGGC TTGTCACTCG-3'，PCR扩增片段长度为149 bp。IL-6基因引物：上游序列5'-AGACTTCACAGAGGA TACCACCCAC-3'；下游序列5'-CAATCAGAATTGC CATTGCACAA-3'，PCR扩增片段长度为129 bp。IL-1β基因引物：上游序列5'-ACAAGGAGAGACA AGCAACGACAA-3'；下游序列5'-TTTCCATCTTCT TCTTTGGGTATTG-3'，PCR扩增片段长度为149 bp。MCP-1基因引物：上游序列5'-CAGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAGTA-3'；下游序列5'-AGGTGCT GAAGTCCTTAG GGTTGAT-3'，PCR扩增片段长度为172 bp。MCP-5基因引物：上游序列5'-ACCAGATTCAGTGTTCACCCCAGT-3'；下游序列5'-GCT GCTTGTGATTTTCCT GTAGCTC-3'，PCR扩增片段长度为100 bp。MIP-1α基因引物：上游序列5'-GCAGACAGTGGCAGGGATT-3'；下游序列5'-CACCCTTTAGCATCTTTTGGAC-3'，PCR扩增片段长度为173 bp。MIP-2基因引物：上游序列5'-CAATGCCTGACGACCCTACC-3'；下游序列5'-TTG-GACGATCCTCTGAACC-3'，PCR扩增片段长度为100 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAA CCCATCACCA-3'；下游序列5'-ACGCCA GTAGAC TC-CACGACAT-3'，PCR扩增片段长度为96 bp。红景天苷由福建中医药大学生物医药研发中心提供，纯度为99%；iNOS多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-651）、COX2多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：sc-23984）、β-actin抗体（碧云天生物技术有限公司，批号：H015）。

2 实验方法

2.1 脑缺血再灌注动物模型制作大鼠术前禁食12 h，自由饮水，腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，仰卧位固定，将尼龙单丝线栓从左颈总动脉插入到大脑中动脉的起始端，栓塞后2 h，将线栓拔出致血液再灌注，假手术组动物不栓塞中脑动脉。造模过程中，连续监测动物的温度，并保持温度在37℃。根据Longa［8］评定法对造模动物进行神经功能损伤程度评价，评级达3～4为模型动物，可用于实验。

2.2 分组与给药应用随机对照试验方法将36只大鼠分为假手术组、模型对照组和红景天苷给药组各12只。红景天苷给药组在造模成功后，立即腹腔注射红景天苷（50 mg·kg-1），其余2组腹腔注射同容积的生理盐水。24 h后，3组动物断头取脑组织，用于分析。

2.3 神经功能损伤评价根据Longa评定法［8］，0级：无缺陷；1级：不能伸展对侧前肢；2级：对侧前肢屈曲；3级：轻度向对侧转圈；4级：严重的转圈；5级：对侧瘫痪。

2.4 TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2检测按照QIAGEN RNeasyMini Kit试剂盒提取总RNA，用Fermentas的RT逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，建立qPCR体系为20 μL，反应条件为50℃2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，退火58℃15 s，聚合72℃20 s 40个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt法计算各组间mRNA的表达量。

2.5 Western blot检测大鼠患侧脑组织iNOS与COX-2的蛋白表达提取总蛋白，总蛋白经SDSPAGE垂直板全湿法电泳法分离后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜，用封闭液封闭2 h后加入稀释的一抗（iNOS多克隆抗体1∶800，COX-2多克隆抗体1∶500，β-actin单克隆抗体1∶3 000），4℃下孵育过夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀释HRP标记的第二抗体，室温下孵育2 h后，TBS洗3遍，每次10 min。之后加ECL显色剂经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对量，并统计各组之间的差异。

2.6 统计学处理用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，各组数据间的差别用ANOVA方法分析。

3 结果

3.13 组患侧脑组织TNF-α、IL-6与IL-1β等炎症细胞因子mRNA表达比较见图1。

3.23 组患侧脑组织MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等趋化细胞因子mRNA表达比较见图2。

3.33 组患侧脑组织iNOS与COX-2蛋白表达比较见图3和图4。

4 讨论

缺血性脑卒中由于局部区域血流不足，引起兴奋性毒性，氧化应激，钙超载等一系列早期事件，从而激活胶质细胞分泌TNF-α、IL-6与IL-1β等促炎性细胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等趋化因子等炎症介质，导致血液来源的炎性细胞，包括中性粒细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞等，渗透到脑缺血区域，浸润的白细胞进一步释放这些细胞因子和趋化因子，引起神经胶质细胞的进一步活化，从而产生炎症信号级联扩大反应，释放各种细胞毒性成分，破坏血脑屏障，进一步加重免疫损伤和神经元死亡等晚期事件。总之，TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等炎症介质对脑卒中后炎性损伤具有重要作用［1-4］。因此，有效抑制脑卒中后TNF-α、IL-6与IL-1β等促炎性细胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等趋化因子等炎症介质的表达，有助于抑制脑卒中后炎性损伤。我们的研究结果表明，脑缺血后红景天苷具有抑制TNF-α、IL-6与IL-1β等促炎性细胞因子及MCP-1、MCP-5、MIP-1α与MIP-2等趋化因子表达的抗炎作用。

iNOS和COX-2与脑卒中炎性损伤关系密切。在脑缺氧/缺血，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在浸润巨噬细胞和活化的小胶质表达增加，导致缺血性损伤［2-4］，此外，PGE2是与炎症有关的重要介质。COX-2是PGE2生物合成的限速酶，这在大脑中的局部缺血后损伤中起关键作用。我们的研究结果表明，脑缺血后红景天苷的抗炎作用与iNOS和COX-2表达的抑制有关。

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R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0046-03

2016-09-12

福建省卫生厅课题（WZZY201305）

魏艺聪（1981—），讲师，硕士，研究方向：中药药理研究。

洪桂祝（1966—），女，教授。E-mail：guizhuhong@yahoo. co.uk