五味子不同产地、部位及提取工艺对木脂素成分含量影响的研究

肖瑞颖，王 伟，钱俊峰

(天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，天津 300112)

五味子不同产地、部位及提取工艺对木脂素成分含量影响的研究

肖瑞颖，王 伟*，钱俊峰

(天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，天津 300112)

目的：探究五味子药材不同产地、不同部位及不同提取方式对木脂素成分含量的影响，为本厂含有五味子的品种选择适宜的药材产地及工艺提供科学的理论依据。方法：采用高效液相色谱法(HPLC)测定不同产地、不同部位五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量；同时，分别考查不同提取工艺(水煮、不同乙醇体积分数热回流、渗漉)对木脂素类含量的影响，使用正交试验方法进一步优化确定五味子渗漉工艺对四种木脂素类成分的最佳提取条件。结果：不同产地五味子木脂素成分都主要集中在种仁中，果皮中的含量较少；以乙醇热回流及渗漉提取工艺对木脂素成分的含量提取效果好，正交试验中以乙醇体积分数的影响最为显著，其次是提取倍数。结论：五味子中有效成分主要存在于种仁中，在大生产工艺中，需将五味子破碎，有利于有效成分的煎出；在提取工艺中，提示在工业化生产过程中，尽量选取体积分数较大的乙醇，以便提取完全。

五味子，木脂素，提取法，正交试验

五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效[1]，始载于《神农本草经》[2]，列为上品。现代药理研究证明五味子具有增强心血管功能[3，4]、降血糖[5]、保肝[6]、抗氧化抗疲劳，延缓衰老[7，8]、镇静催眠[9]、保护脑神经细胞[10]、抗肿瘤[11]等作用，而木脂素成分是五味子的主要活性成分。本厂目前有多个品种处方中含有五味子药材，其提取方式及检测指标各异。故本试验拟对五味子不同产地、不同部位、不同提取方式进行木脂素含量测定，分析五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素在不同部位中的分布规律，根据成药的功效需求选择适宜的药材产地及提取工艺，以期可为本厂现有品种的工艺优化提供依据，对今后大品种开发及新品研发中的工艺选择也具有指导意义。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters)；超声清洗器SK8200LH(天津星亚玻璃仪器销售公司)；sartorius CP225D(十万分之一天平)；sartorius CP224S (万分之一天平)；电热鼓风干燥箱DGG-101-1(天津天宇)；调温电热套ZDHW(北京中兴伟业仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-52AA(上海亚荣)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。北五味子(批号1507336，1509231)、南五味子(批号1509232)药材均购自天津中药饮片厂，均符合2015年版《中国药典》规定。五味子醇甲(批号110857-200405)、五味子酯甲(批号111529-200604)、五味子甲素(批号110764-201111)、五味子乙素(批号110765-200407)均为含量测定用，购自中国药品生物制品检定所。甲醇(天津市康科德科技有限公司)为色谱纯；乙腈(EMD Millipore Corporation)为色谱纯；甲醇(EMD Millipore Corporation)为色谱纯；95%乙醇(天津市康科德科技有限公司)；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Shim-pack C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以甲醇流动相A，水为流动相B进行梯度洗脱(0～25 min，62%A；25～37min，62%A～80%A，37～50 min，80%A～90%A)，检测波长：217 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：35 ℃，进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得含五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分别为69.20、36.2、40.8和48.2 μg/ml的混合对照品溶液，保存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末约0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超声处理30 min，冷却至室温，加甲醇补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸取对照品和供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。

1. 五味子醇甲 2. 五味子酯甲 3. 五味子甲素 4. 五味子乙素

2.3 线性关系考查 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10和12 μl，按“2.1”项色谱条件进样，测定，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)绘制标准曲线，计算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的回归方程分别为Y=884 789X+881 473(r=0.999 3)、Y=367 322X+366 547(r=0.999 3)、Y=601 100X+561 909(r=0.998 2)和Y=676 157X+705 425(r=0.999 6)，结果表明五味子醇甲在138.4～830.4 μg、五味子酯甲在72.4～434.4 μg、五味子甲素在81.6～489.6 μg、五味子乙素在96.4～578.4 μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μl，按“2.1”项下色谱条件进样6次，计算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为0.92%、0.82%、1.10%和0.90%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性考查 精密称取同批五味子样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素质量分数的RSD分别为1.8%、1.4%、2.0%和1.7%，表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12和24 h进样10 μl进行分析，测定峰面积值，计算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD值分别为0.96%、0.86%、1.04%和0.98%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验 精密称取已知指标成分含量的五味子药材粉末9份，每份约0.125 g，分别精密加入高、中、低质量浓度的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均加样回收率分别为97.23%、97.67%、98.38%和96.14%，RSD依次为1.8%、1.4%、1.8%和1.6%。

2.8 样品测定 精密称取不同样品0.25 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算各指标成分含量，结果见表1。

3 工艺路线的确定

3.1 水提取工艺 取批号为1507336的五味子100 g，用水煮两次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20，烘干，称重，备用。

3.2 乙醇热回流工艺 取批号为1507336的五味子100 g，分别选用60%乙醇、80%乙醇和90%乙醇热回流两次，第一次4倍量4 h，第二次2倍量2 h，合并水煮液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.18～1.20，烘干，称重，备用。

表1 不同产地、不同部位五味子4种木脂素成分的含量及占比

3.3 渗漉工艺正交试验设计 参考企业品种含有五味子的工艺参数，取批号为1507336的五味子药材，平均分成若干份，每份100 g，以五味子木脂素的转移率及出膏率为考查指标，以乙醇体积分数、乙醇用量、渗漉速度为考查因素，对五味子渗漉工艺进行考查。试验设计水平因素见表2。

表2 L9(34)正交试验水平因素表

3.4 各提取方式对4种木脂素含量的影响 取各提取样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算各指标成分含量，结果见表3。

表3 不同提取方式对五味 子中4种木脂素含量的影响

3.5 渗漉工艺样品含量测定及结果 取9份样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算各指标成分含量。对正交结果进行多指标综合评分[12]。评分时以各指标最大值作为参照对数据进行归一化，再给出不同权重，总木脂素转移率与出膏率权重系数分别设为0.7和0.3。以综合值进行统计分析，结果见表4。综合评分(M)=[(PA×Ai/A优)+(PB×Bi/B优)]×100，式中PA为转移率权重系数，Ai为转移率指标测定值，A优为转移率指标最大值；PB为出膏率权重系数，Bi为出膏率指标测定值，B优为出膏率指标最大值。

表4 L9(34)正交试验各指标测定值分析结果

3.6 正交试验结果分析 正交试验各指标测定结果及极差分析结果见表5。由直观分析结果看出：各因素对结果的影响次序为A>B>C，最佳提取工艺为A2B3C3。但以极差最小的C因素为误差项进行方差分析发现，因素对试验结果均无显著性差异，且综合考虑大生产时成本问题及操作问题，确定最佳提取工艺为A2B2C3，即用80%乙醇，渗漉速度为6 ml/kg·min-1，收集7倍量渗漉液。

4 讨论

4.1 五味子木脂素含量在方法学试验中采用单因素方法，考查了不同提取方式(回流和超声)、不同溶剂(50%甲醇、甲醇、60%乙醇和95%乙醇)、不同提取时间(10、20和30 min)对五味子木脂素的影响，结果显示甲醇超声提取30 min效果最好。

4.2 通过考查不同产地五味子，发现其木脂素成分都主要集中在种仁中，果皮中的含量较少；提示在大生产过程中，需将五味子破碎，将果仁充分暴露，这样有利于有效成分被完全提取。

4.3 本文通过对五味子不同提取方式进行试验，可以看出：水提取时出膏率高，但其总木脂素含量较低，因为五味子木脂素亲脂性较强，在水中溶解度较低，尽管加热木脂素类成分转移率也较低；同时通过正交试验方法对五味子渗漉工艺进行优化筛选，发现乙醇体积分数越高，对五味子木脂素的提取率越高，提取倍数越多，出膏率也随之增加，从效果及成本方面综合考虑，建议选取80%乙醇，7倍量进行渗漉；而较高浓度乙醇热回流方式与渗滤工艺效果相当，提取木脂素效果均较好，分析是因为亲脂性较强的五味子木脂素在高浓度的乙醇中溶解度较大，说明五味子适合较高浓度乙醇提取。

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11 姜恩平，李贺，于春艳，等．五味子乙素通过 p38MAPK信号通路对结肠癌 SW480 细胞凋亡和侵袭的影响[J].吉林大学学报·医学版，2015,41(4):675-679

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2016-07-15

R94

A

1006-5687(2016)05-0008-04

*通讯作者：王伟，E-mail: lrtjs@126.com。