大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白表达的时空变化规律及作用

朱彦东，周开升，郭永强，江龙，郑利强，汪静，李森，龙在云，伍亚民，张海鸿

大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白表达的时空变化规律及作用

朱彦东1,2，周开升1,2，郭永强1,2，江龙1,2，郑利强1,2，汪静2，李森3，龙在云3，伍亚民3，张海鸿1

目的探究大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白(SKIP)的表达及其变化规律。方法60只成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组(n=30)和打击组(n=30)，每组分为1 d、3 d、5 d、7 d、14 d五个时间点，各6只。打击组用Allen法制作T10打击损伤模型，假手术组只咬开椎板。采用BBB评分评价后肢运动功能；尼氏染色观察损伤后脊髓神经元的病理变化；免疫荧光染色观察损伤脊髓SKIP的表达情况。结果打击组各时间点BBB评分均显著低于假手术组(t＞48.267,P＜0.001)。与假手术组相比，打击组5 d脊髓神经元胞浆中尼氏小体开始崩解、凝聚，分布不规则，神经元变性坏死，14 d时损伤加重。免疫荧光染色显示，SKIP主要在脊髓灰质中表达，白质中极少表达；损伤后SKIP表达逐渐上升，5 d时达到高峰(t=-17.035,P＜0.001)，14 d时明显降低(t=3.853, P＜0.05)。结论SKIP可能是一种作用于神经元并影响其凋亡的新的信号分子。

脊髓损伤；ski相关蛋白；神经元；凋亡；大鼠

[本文著录格式]朱彦东，周开升，郭永强，等.大鼠脊髓损伤后ski相关蛋白表达的时空变化规律及作用[J].中国康复理论与实践,2017,23(8):912-918.

CITED AS:Zhu YD,Zhou KS,Guo YQ,et al.Temporal and spatial variation of ski-interacting protein expression in rats after spinal cord injury and its role[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(8):912-918.

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)多源于创伤性损害，例如车祸、物理性打击、高处坠落以及运动性损害等[1]。随着社会快速发展，脊髓损伤发病率呈逐年上升趋势。脊髓损伤后症状复杂、截瘫发生率高、病理变化多变，能够改善愈后的治疗措施非常有限，脊髓损伤如今已成为亟待攻克的医学界难题之一。

ski相关蛋白(ski-interacting protein,SKIP)是一种细胞核激素受体共活化物，可与原癌基因ski结合来调节细胞的增殖与分化。此外，作为一种特殊的转录辅助因子，SKIP涉及多种信号传导通路的调控过程[2-3]，比如病毒性原癌基因v-ski、转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)、特异性Smad蛋白，这些信号传导通路在中枢神经系统中起着广泛的作用，参与脊髓损伤后的一系列病理生理变化。此外，最近的一些研究发现，脑损伤后SKIP在大脑皮层中的表达量显著升高；视神经损伤后，视网膜神经节细胞内SKIP的表达量也明显升高；外周神经损伤后SKIP的表达量也有一定升高[4-6]。

本研究旨在初步探究大鼠脊髓损伤后SKIP的表达及其变化规律，为进一步探究其在脊髓损伤后的作用及其作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

60只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，SPF级，体质量180～220 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供。实验开始前1周，将大鼠饲养于动物实验室，保持室温25～28℃，给予自然昼夜采光，自由进食、水，定期更换垫料。动物的饲养及实验过程均遵守实验动物管理及保护规定。将60只大鼠编号，按随机数字法分为假手术组和打击组，各30只。

1.2 主要仪器与试剂

RM2007型Allen打击器：美国新泽西州大学。CM1900冰冻切片机、SP-2激光共聚焦显微镜：LEICA公司。尼氏(Nissl)染液试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司。SKIP抗体、NeuN抗体、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体：美国MILLIPORE公司。Alexa Fluor®488标记山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor®488标记山羊抗鸡IgG(H+ L)：北京中杉金桥。iFluor 647标记山羊抗小鼠IgG (H+L)、iFluor 647标记山羊抗兔IgG(H+L)：碧云天。

1.3 动物模型

1%戊巴比妥钠40 mg/kg经腹腔注射麻醉大鼠，待其角膜反射消失后剃去手术区域皮毛，俯卧位固定于手术台上，术区皮肤用碘伏消毒。定位T10，以T10为中心在背部正中切一长约2 cm的纵行切口，逐层分离筋膜、肌肉至露出椎板，咬开T9-11椎板，显露脊髓(硬脊膜完整)。设定Allen打击强度为10 g×25 mm，实验大鼠打击T10脊髓，打击后大鼠双侧后肢及尾巴出现痉挛性抽搐，脊髓打击部位充血肿胀则视为打击成功。假手术组仅咬开椎板，显露脊髓。打击完成后逐层缝合伤口，给予青霉素1.6×105U肌肉注射，连续3 d；术后大鼠自由进食、水，饲养于室温25～28℃的动物实验室内，每日早、中、晚按摩、挤压膀胱协助其排尿，直至自主排尿功能恢复。

1.4 评定方法

1.4.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分

于造模后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d，分别取6只大鼠进行1次BBB评分，以评估大鼠双侧后肢运动功能。评分方法：将大鼠放入旷场内，任其自由活动，观察双侧后肢运动功能5 min，并按照相应标准进行评分。每只实验大鼠的评分均由2名熟悉BBB评分法的非本组实验人员完成。其中1 d及3 d时，若评分高于2分则视为造模失败，剔除后重新造模补充。

1.4.2 尼氏染色

每一时间点评分完成后，两组各取3只大鼠，成功麻醉后暴露心脏，0.01 mol/L PBS经左心室快速灌注，直至右心耳流出清亮液体，肝脏变白之后改用4%多聚甲醛快速灌注。固定30 min后取出脊髓组织，置于4%多聚甲醛中继续固定24 h。在30%蔗糖PBS溶液中充分脱水后，以T10中心、上下各留3～4 mm，截取脊髓组织6～8 mm，使用O.C.T冰冻切片包埋剂包埋，从上至下连续切片(横切)后行尼氏染色，观察脊髓损伤后尼氏小体的病理变化。

1.4.3 免疫荧光单标染色

每个时间点各另取3只大鼠，按上述方法冰冻切片后行免疫荧光单标(SKIP)染色。0.01 mmol/L PBS冲洗5 min，共3次，0.3%Triton X-100配制10%山羊封闭血清溶液，并用此溶液破膜封闭60 min，甩干后不洗，添加相应SKIP抗体(1∶100)，置于4℃冰箱中过夜；次日取出，室温下复温，0.01 mmol/L PBS冲洗5min，共3次；在避光条件下添加山羊抗兔Alex fluor488(1∶200)，37℃烤箱中反应1 h，0.01 mmol/L PBS冲洗5 min，共3次，4'6-二脒基-2-苯基吲哚(4' 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核2 min，再次用0.01 mmol/L PBS冲洗5 min，共3次，甩干后甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。

1.4.4 平均光密度分析

选取距离损伤中心下端约2 mm、结构比较完整的组织切片，免疫荧光单标染色后用激光共聚焦显微镜在固定参数下扫描，选择同一放大倍数的荧光照片，用Image J 1.4软件分析计算得出阳性细胞面积(Area)及阳性细胞总光密度值(IntDen)，IntDen/Area得出平均光密度值后进行统计分析。

1.4.5 免疫荧光双标染色

选取上述步骤切好的切片，行免疫荧光双标染色，染色方法同1.4.3。一组切片所用一抗为SKIP(1∶100)+NeuN(1∶5000)，对应荧光二抗为山羊抗兔Alex fluor488(1∶200)+山羊抗小鼠iFluor647(1∶200)。另一组切片所用一抗为SKIP(1∶100)+GFAP(1∶1000)，对应荧光二抗为山羊抗鸡Alex fluor488(1: 200)+山羊抗兔iFluor647(1∶200)。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分

打击组1 d、3 d组评分均为0～1分；之后后肢功能开始缓慢恢复，14 d时评分达到6分左右。打击组各时间点评分均显著低于假手术组(P＜0.001)。见表1。

2.2 尼氏染色

假手术组脊髓神经元胞浆中尼氏小体结构完整、清晰，单个存在且呈特征性分布；与假手术组相比，打击组在打击5 d时，尼氏小体开始崩解、凝聚、分布杂乱没有规则；到14 d时凝聚加重。见图1。

2.3 免疫荧光单标染色

假手术组SKIP微量表达，且主要分布于灰质神经元中，白质中几乎无表达。与假手术组相比，打击组1 d和3 d时，SKIP表达增强；5 d时，脊髓灰质中SKIP表达达到顶峰，荧光信号显著增强；随后开始下降，打击14 d时，SKIP表达较5 d、7 d时明显下降。见图2。

2.4 光密度值

与假手术组比较，打击1 d时SKIP轻微升高(P＜0.05)，打击3～7 d时SKIP表达明显增高(P＜0.01)，5 d时达到高峰，打击14 d时SKIP表达低于假手术组(P＜0.05)。见表2。

2.5 免疫荧光双标染色

为了进一步明确SKIP在脊髓中的表达位置，我们选择假手术组以及与假手术组相比SKIP表达明显增强的打击组5 d，选取距离损伤中心约2 mm的脊髓组织切片行SKIP+Neun以及SKIP+GFAP免疫荧光双标染色。

假手术组脊髓灰质中只有神经元的特异性标志物NeuN高度表达(红光)，SKIP表达微弱(绿光)；而在打击组5 d，SKIP和NeuN均高度表达，且有共表达信号。在脊髓白质中，无论是假手术组还是打击组，SKIP均微弱表达(红光)，仅有GFAP表达(绿光)，无二者共表达信号。见图3。

3 讨论

脊髓损伤后，各种损伤因素常常导致暂时性或者持久性、部分或者完全性感觉、运动功能障碍，并且伴随着严重的神经功能紊乱症状[7-8]、自主神经反应障碍、抽搐、脑卒中、血管病变及心脏骤停等[9]。当前针对脊髓损伤的治疗方法主要着眼于减轻疼痛和瘫痪，并非促进脊髓功能的康复。脊髓损伤临床治疗方法的局限性让越来越多的研究者将其研究方向着眼于探寻脊髓损伤后的演变过程及其深层的病理生理变化机制，以求寻找出针对脊髓损伤病变过程中不利因素的治疗措施。

研究发现，脊髓损伤后的病理变化分为早期改变和晚期改变。早期改变由创伤性因素导致脊髓正常结构破坏，包括轴突断裂、病灶挫伤、血肿等。晚期改变与生化因素、新陈代谢变化以及细胞变性相关[10]。脊髓损伤之后的数小时到数天时间里，由原发创伤因素诱发一系列分子及细胞变化，例如神经细胞凋亡[11]、胶质增生、炎症反应[12]，这些病理生理变化将会导致继发性组织损伤、再生障碍以及神经功能缺陷。其中神经细胞大量凋亡，将会严重影响到神经传导功能。

有研究指出，细胞周期重启是神经元凋亡过程中的一个重要程序，并且神经元凋亡过程与细胞周期激活过程有相同的信号通路[13-14]。SKIP是一种新发现的多功能蛋白，作为一种剪接体元件和转录辅助因子，是多种重要的诱导基因不可或缺的转录激活物。有研究发现，SKIP在细胞周期重启过程中起着非常重要的作用[15]，与多种肿瘤的发生发展及预后密切相关[16-18]。此外它也涉及到神经系统损伤的多种病理生理过程，例如，SKIP通过增强依赖TGF-β的转录途径诱发损伤后炎症反应的发生发展、脑外伤后诱导病理性神经元凋亡[4]，在外周神经沃勒变性过程中SKIP可以促进施万细胞增殖[6]。

本研究结果发现，SKIP在正常脊髓中仅微量表达，但脊髓损伤后SKIP表达随着时间推移逐渐增高，至损伤3 d时相比正常脊髓明显增加，到损伤后5 d时达到顶峰，随后开始降低，到损伤后14 d时仅微量表达。

尼氏小体与神经元的功能关系密切，其数量和形态变化可以间接反映神经元的病理生理变化[19]。通过对损伤中心下端脊髓组织进行尼氏染色后发现，损伤后5 d时，脊髓神经元胞浆中的尼氏小体开始崩解、凝聚、分布不规则，神经元变性坏死；至损伤后14 d时损伤加重，尼氏小体大部分凝聚，这就说明SKIP的表达变化先于尼氏小体的病理变化。

为了进一步明确SKIP在脊髓组织中的表达部位以及与神经元的关系，采用神经元的特异性标记抗体NeuN与SKIP进行免疫荧光双标染色，同时使用胶质纤维特异性标记抗体GFAP与SKIP双标作为对比，以SKIP表达显著的损伤后第5天为例，结果表明，脊髓损伤后，SKIP主要在脊髓灰质神经元中表达，其荧光信号定位于脊髓灰质神经元中。

既往的研究表明，神经元凋亡与细胞周期重启有高度相关性，二者具有相同的调控因素，例如视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,Rb)、E2F转录因子等[20-21]。Rb蛋白通过与转录辅助因子E2F家族相互作用在对细胞周期的调控中起着非常重要的作用[22]。有研究指出，一些急性或慢性神经变性疾病与细胞周期调节蛋白(如Rb和E2F1)的异常激活有密切关系[23-24]。另有研究发现，SKIP可以与原癌基因ski竞争结合Rb，并且解除Rb抑制转录的活性[25]，而Rb抑制转录的能力对于维持神经元的稳定十分重要。因此，根据我们现有的研究结果，推测SKIP可能通过抑制Rb的活性激活细胞周期，从而导致神经元凋亡；然而，这一猜想还需进一步实验研究证实。

综上所述，本研究初步明确SKIP在脊髓损伤后的表达及分布规律，并为进一步研究SKIP在脊髓损伤后的作用提供了理论依据。

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Temporal and Spatial Variation of ski-interacting Protein Expression in Rats after Spinal Cord Injury and its Role

ZHU Yan-dong1,2,ZHOU Kai-sheng1,2,GUO Yong-qiang1,2,JIANG Long1,2,ZHENG Li-qiang1,2,WANG Jing1,2,LI Sen3,LONG Zai-yun3,WU Ya-min3,ZHANG Hai-hong1
1.Department of Orthopedics,Second Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu 730030, China;2.Key Laboratory of Orthopedics of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China;3.State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,the Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China

ZHANG Hai-hong.E-mail:zhanghaihong1968@sina.com

ObjectiveTo explore the expression and change of ski-interacting protein(SKIP)in rats after spinal cord injury.Methods A total of 60 adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=30)and spinal cord injury(SCI)group(n=30), each group was further divided into five time points including one day,three days,five days,seven days,and 14 days with six rats in each time points.The model was established at T10with modified Allen's technique,and the sham group only bit the lamina of rats.The hindlimbs behavior was assessed with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score at each time point.The pathological changes of spinal cord neurons were detected with Nissl staining.The expression of SKIP were observed with immunofluorescence staining.Results The BBB scores were significantly lower in each time point in SCI group than in the sham group(t＞48.267,P＜0.001).Compared with the sham group,Nissl bodies in the cytoplasm of spinal cord neurons began to disintegrate,coalesce and irregularly distribute,the neurons began to degenerate and die on the fifth day,and the damage deteriorated on the 14th day.Immunofluorescence staining showed that SKIP expression was mainly expressed in the gray matter of the spinal cord and little expressed in the white matter.The expression of SKIP gradually increased after SCI,and reached a peak on the fifth day(t=-17.035,P＜0.001)and decreased significantly on the 14th day(t=3.853,P＜0.05).Conclusion SKIP may be a new signaling molecule,which play an important role in neuronal apoptosis after SCI.

spinal cord injury;ski-interacting protein;neuron;apoptosis;rats

R651.2

A

1006-9771(2017)08-0912-07

2017-03-06

2017-04-11)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.08.009

国家自然科学基金项目(No.30772299)。

1.兰州大学第二医院骨科，甘肃兰州市730030；2.甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃兰州市730030；3.第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042。作者简介：朱彦东(1989-)，男，汉族，甘肃天水市人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱脊髓损伤。通讯作者：张海鸿，主任医师，副教授，硕士研究生导师，主要研究方向：脊柱外科。E-mail:zhanghaihong1968@sina.com。