间充质干细胞免疫调节类风湿关节炎的研究进展

刘 涛 宋 敏 巩彦龙 董万涛 李清林 孙定平 周灵通

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

间充质干细胞免疫调节类风湿关节炎的研究进展

刘 涛 宋 敏 巩彦龙 董万涛1李清林 孙定平 周灵通

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

类风湿关节炎;间充质干细胞;研究进展

类风湿关节炎(RA)是一种慢性全身性疾病，主要影响滑膜关节，导致关节破坏和功能障碍。据报道全世界RA的患病率是0.5%～1%，每年有400万新发病例〔1〕。RA的发展是由免疫系统功能障碍所介导的，但确切的致病机制仍不清楚。RA的病理特征是关节滑膜的慢性炎症(滑膜炎)，通过浸润型炎症、免疫细胞以及成纤维样滑膜细胞(FLSs)之间的相互作用导致软骨和骨组织受侵蚀。RA一旦形成，侵蚀不会停止，会造成关节持续性的损害。研究证实，新的靶向治疗已经取得了很大的成功，例如，肿瘤坏死因子(TNF)-α抑制剂治疗和B细胞耗竭治疗使很多RA患者受益。然而，这些治疗方法价格昂贵，并且目前使用的生物制剂达不到长期治疗效果〔2〕。因此，开发新的和更有效的治疗RA的方法是必要的。间充质干细胞(MSCs)在骨骼肌系统的治疗和再生方面最具前景,尤其在软骨再生方面。MSCs还具有来源广、容易获取、易培养、克服免疫排斥、能在宿主体内长期存活等优点，在治疗RA领域具有广阔的前景。

1 MSCs的生物特性

MSCs由于具有旁分泌作用、多向分化潜能、免疫调节特性，目前已经开展广泛的移植治疗研究。骨髓是这些细胞首要来源〔3〕。由于没有明确的MSCs标记，国际细胞治疗协会已经建立了最低标准，这些在体外细胞必须符合这些特点，才被认为是MSCs。细胞表面标志CD105、CD73、CD90高表达，MHC-I类分子低表达， MHC-Ⅱ、CD11b、CD14、CD34、CD45、CD31表达较少〔4〕。此外，这些细胞必须能够在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。体外培养MSCs具有3种生物特性，才将其用于细胞疗法：(a)分化潜力；(b)营养因子，有利于组织重塑的分泌；(c)免疫调节特性〔5〕。

在过去的几年中，已经确定了其他几个MSCs来源。经过骨髓衍生的MSCs(BM-MSCs)，脂肪组织来源的MSCs(AT-MSCs)，与生育相关的MSCs(脐血、脐带和胎盘组织，分别简称UCB-MSCs、UC-MSCs和PL-MSCs),在临床上最常用的BMSCs的来源〔6〕。不同来源的MSCs的表型和功能特点是相似的。然而有细微的差别，这可能会导致从微环境生态位、局部功能(BM-MSC的造血支持作用和AT-MSC的免疫平衡)和个体发育年龄在分离和培养中被诱导。CD106就是一个例子，因为它是在AT-MSCs中相比其他MSC显著降低。CD34，出现在AT-MSC原代和早期的培养中，而没有在其他的MSCs。对于功能，UCB-MSC成脂分化能力明显降低。对于基质支持的能力，最近的研究表明，只有BMSCs能够形成功能性造血微环境，而脂肪组织、脐带和皮肤中培养MSCs则不能〔7〕。

2 MSCs的免疫调节作用机制

MSCs可以发挥广泛的调节作用于细胞的先天性和适应性免疫反应。MSCs对T细胞的影响包括CD4+T细胞增殖受有丝分裂原(如植物血凝素或抑制刀豆蛋白A)或抗体(抗CD2、CD3和CD28)反应抑制。此外，MSCs可以通过T细胞抑制白细胞介素(IL)-2、TNF-α的产生。MSCs也可诱导经典CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)的分化并保持其抑制功能。MSC对T细胞的影响已被证明是依赖于干扰素(IFN)-γ。除了对T细胞介导的免疫反应的调节，MSCs在体外能抑制B细胞的功能和分化〔8〕。此外，B细胞向炎症部位趋化作用可以通过降低B细胞表面表达趋化因子受体CXCR4、 CXCR5和CCR7抑制。当B细胞与MSCs共培养时，这些效应对趋化因子受体已被证明是由IFN-γ取决。与先天免疫细胞的关系，MSCs能抑制来自单核细胞的树突状细胞(DC)产生，减少表达人白细胞DR抗原(HLA-DR)和抗原提呈细胞(APC)上共刺激分子CD80和CD86。此外，由于MSCs的作用，APC使促炎性细胞因子如IL-2、IFN-γ和TNF-α减少和增加IL-10的产生。相对于NK细胞，MSCs可以降低静息和IL-2激活的NK细胞的增殖及细胞毒性和IFN-γ的产生〔9〕。

MSCs的免疫调节机制包括分泌吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)。IDO可以催化一种必需氨基酸色氨酸为犬尿氨酸，这对各种细胞的蛋白质的合成，导致细胞增殖的抑制作用。由MSCs产生的其他可溶性因子包括一氧化氮合酶(iNOS)，诱导巨噬细胞产生一氧化氮，从而抑制细胞增殖。其他免疫抑制被MSCs介导机制包括肝细胞生长因子、转化生长因子β、血红素氧合酶-1和HLA-G5。除了可溶性因子，细胞MSCs与T细胞细胞间联系也可以抑制T细胞功能，通过持续性CD69的表达和增加Treg相关基因的转录水平获得调节表型标志〔10〕。

3 MSCs 的分类和实验及临床应用

3.1 滑膜间充质干细胞(S-MSC) S-MSC属于MSCs家族,S-MSCs用于在免疫抑制治疗已被广泛接受，其可以有效抑制活化的淋巴细胞增殖。虽然培养的S-MSC细胞形态和表型与BM-MSC相似，S-MSC有几个优势。S-MSC在动物模型中较骨髓以及肌肉和脂肪MSCs有更大的增殖率〔11〕。此外，不管供体年龄和传代培养发生变化，S-MSC都能保持其增殖能力。比较S-MSC与皮肤衍生MSCs显示后发现，后者具有较少的免疫抑制特性，特别是受到IFN-γ刺激〔12〕。总之，S-MSC可以作为治疗RA的MSC治疗源。S-MSCs提取是从病变关节，如OA、RA和损伤的交叉韧带。Koizumi等〔13〕提取分别来自病变OA、RA的S-MSC,从滑膜细胞增殖能力、炎症因子基因表达水平、诱导成软骨细胞的潜力等比较发现，认为其具有良好的潜在应用价值，可以通过无支架组织工程方法修复软骨，并且其在少量的滑膜组织提取通常是足够的。S-MSCs还可以在关节不同部位提取，如髌上囊、髌下脂肪垫和外侧或内侧关节区域。然而，来自不同关节部位的S-MSCs的能力不同。已经注意到，从外侧部位收获的S-MSCs有较高的增殖率相比与其他区域〔14〕。这反映了需要更多的研究，了解不同的解剖区域内的关节S-MSCs的免疫抑制能力之间的差异。

3.2 BMSCs BMSCs可以减少促炎细胞因子和抗炎细胞因子，诱导调节性T细胞的表达。Park等〔15〕在DBA/1小鼠胶原诱导的关节炎中发现BMSCs显著降低血清IL-1β，TNF-α、IL-6和IFN-γ和增加IL-10和转化生长因子(TGF)-β水平。Lee等〔16〕通过实验发现，BMSCs可以诱导抗炎因子和抗原特异性T细胞产生的生产，BMSCs通过抑制炎性细胞因子(主要由巨噬细胞和T细胞产生)和活化T细胞改变DBA/1小鼠RA发病机制。Wei等〔17〕从小鼠骨髓分离培养MSCs，并在体外通过不同浓度的IL-6诱导BMSCs向软骨细胞分化，通过检测骨料的组织学和组织化学的性质，表明IL-6呈剂量依赖性抑制骨髓MSCs向软骨细胞的分化。Park等〔18〕通过注射TGF-β转导的BMSCs，发现可以预防RA的发展和减少骨侵蚀和软骨的破坏。TGF-β转导的BMSCs抑制Ⅱ型胶原特异性T淋巴细胞增殖,下调促炎性细胞因子的产生。这些治疗的作用与在腹腔和脾脏Ⅱ型胶原特异性CD4+Foxp3+Treg细胞和Th17细胞形成抑制的增加有关。此外，TGF-β转倒BMSCs抑制破骨细胞的分化。

3.3 UC-MSCs UC-MSCs具有较高的增殖潜能，能降低病毒污染风险和更强的分化能力。UC-MSCs不仅可以抑制成熟树突状细胞的功能，也增加了Treg的免疫调控相关的部分。UC-MSCs具有中胚层分化潜能，使其向软骨细胞分化的潜力增加。这些特性可能是由于部分特定的分泌因子，包括某些类型的细胞因子和生长因子〔19〕。据报道，血小板反应蛋白2能在RA中通过抗炎因子抑制炎症介质的生产，如IFN-γ和TNF-α，诱导滑膜驻留T细胞耗竭和减少关节组织单核/巨噬细胞浸润〔20〕。有研究表明，UC-MSCs能发挥对RA患者FLSs和T细胞抑制作用，响应FLSs的侵袭行为和炎症，抑制T细胞的活化和诱导调节性T细胞的表达。UC-MSCs通过几个可溶性因子，包括IDO、PGE2、IL-10和TGF-β1介导抑制T细胞和FLSs增生。静脉输注MSCs可显著减少小鼠CIA的严重程度，临床表现为改善各种炎性细胞因子和趋化因子的分泌减少，并下调Th1和Th17细胞〔20〕。此外，在UC-MSCs治疗小鼠CIA、Th2/Tregs和IL-10升高。

3.4 脂肪间充质干细胞(ASCs) 脂肪组织是一种干细胞的可再生来源，称为ASCs，能释放伤口愈合的重要生长因子，调节免疫系统，减少炎症反应，靶向治疗受伤组织〔21〕。Gonzalez等〔22〕发现hASCs能抑制RA患者T细胞的抗原特异性反应，hASCs通过胶原活化的CD4和CD8 T细胞抑制增殖反应和炎性细胞因子的产生。与此相反，经过hASCs治疗，IL-10产生的T细胞数和单核细胞数均明显增加。hASCs的抑制活性是通过细胞间直接接触，hASCs也刺激了Foxp3蛋白表达CD4(+)CD25(+)Treg的产生，进而抑制胶原特异性T细胞反应的能力。最后，hASCs通过由RA患者分离的滑膜细胞下调炎症反应和基质降解酶的生产。Lopez-Santalla〔23〕观察到输注hASCs后小鼠RA的严重程度显著下降，并伴随着脾脏和外周血致病性GM-CSF(+)CD4(+)T细胞数量减少，在淋巴结(LNS)中调节性T细胞的不同亚群如FOXP3(+)CD4(+)T细胞和IL-10(+)IL-17(-)CD4(+)T细胞的数量增加。Zhou等〔24〕发现hASCs抑制多种炎症介质的产生，降低抗原特异性Th1和Th17细胞增加，并诱导抗炎因子IL-10的产生。此外，其能诱导抗原特异性Treg细胞的产生与抑制胶原特异性T细胞反应的能力。

3.5 牙龈间充质干细胞(GMSCs) 牙龈组织来源的MSCs，大量存在于人的牙龈。GMSCs易于分离，比BMSCs增殖更迅速。此外，GMSCs在信号通道中显示稳定的形态和功能特征以及不致瘤。Chen等〔25〕在DBA/1J小鼠CIA注入GMSCs，显著降低关节炎病理评分的严重程度，下调炎性细胞因子(IFN-γ、IL-17A)生产，导致CD4+CD39+FOXP3+调节性T细胞增加。

4 MSCs促进RA软骨新生

软骨是一种特殊的结缔组织，在体内再生能力较差，具有自我修复能力。创伤性损伤或自身免疫过程是软骨损伤和退变的主要原因之一，来源于组织工程学中的MSCs能分化为软骨细胞，是新的治疗途径。Arufe等〔26〕对WJ-MSCs软骨潜力分析表明它们具有多潜能和软骨细胞的能力，在关节疾病未来的细胞治疗是有用的。Wang等〔27〕表明，WJ-MSCs在聚羟基乙酸(PGA)支架播种密度，对其成软骨细胞的潜力有重要作用。这项研究表明，WJ-MSCs在三维组织工程具有软骨细胞分化的潜能；较高的播种密度更好地促进生物合成和机械完整性，因而在软骨组织工程WJ-MSCs播种密度至少为2 500万细胞/ml。此外，MSCs能促进透明质酸和聚糖的产生以及关键基因SOX9、COMP的表达Ⅱ型胶原和FMOD〔28〕。Augello等〔30〕在RA小鼠模型关节注射BMSCs可以预防骨和软骨的退变和不可逆的损伤的发生。BMSCs可以诱导T淋巴细胞增殖和调节炎性细胞因子的表达减少，特别是TNF-α的血清浓度显著下降。BMSCs是通过抗原特异性Treg的培养发挥免疫调节作用。总之，由于其分化和免疫调节特性，MSCs是很有前途的软骨修复的细胞疗法。

5 小结及展望

随着分子和细胞生物学、组织工程学及相关学科的发展，MSCs治疗RA的研究取得了很大的进展，MSCs成为治疗RA的最有前途的治疗方法之一。MSCs通过抑制树突状细胞、T细胞和细胞的异常激活的免疫功能，在这些自身免疫性疾病的动物模型中显示良好治疗效果。然而，MSCs应用在RA的实验和临床疗效还存在歧义〔31～33〕。这种矛盾可能是由于几个因素。首先，根据来源和培养条件，MSCs的特性可能是不同；其次，每个实验室采用不同的实验方法，包括路线、数量和注射时间(在发病前和发病后)；第三，根据研究动物模型不同。在临床研究中所使用的每一种动物模型都具有典型的病理生理。因此，没有一个单一的模型可以代表人类疾病和准确的预测MSCs的疗效。总体而言，需要标准化的MSCs使用和适当的动物模型。此外，几个基本问题仍有待回答。首先，因为目前对在体内的MSCs的生理作用了解有限，所以了解MSCs生理功能很重要；其次，对MSCs的治疗机制和疗效、生存时间、分布和组织的引导及对MSCs的作用部位(局部或全身)进行进一步的研究；第三，了解MSCs在淋巴组织中转运，与免疫细胞相互作用的过程也是很重要的。了解MSCs在治疗自身免疫性疾病中的作用机制，有助于扩大MSCs在自身免疫性疾病中的临床应用。

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〔2016-06-17修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金项目(81360554);甘肃省自然科学基金计划(1506RJZA048);甘肃省财政厅基本科研业务课题(BH2010-428);甘肃省中药现代制造工程研究院项目(YWW-2015049)

宋 敏(1964-)，男，教授，博士生导师，主要从事中医药防治颈肩腰腿痛的研究。

刘 涛(1990-)，男，在读硕士，主要从事中医药防治骨关节疾病研究。

R593.22

A

1005-9202(2017)01-0213-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.095

1 甘肃中医药大学附属医院