自分泌/旁分泌效应在缺血再灌注损伤心肌中活化单磷酸腺苷活化蛋白激酶的研究进展

王超综述，赵海滨审校

自分泌/旁分泌效应在缺血再灌注损伤心肌中活化单磷酸腺苷活化蛋白激酶的研究进展

王超综述，赵海滨审校

单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是介导能量代谢的主要蛋白激酶，当心肌发生缺血再灌注损伤时，细胞内单磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)比例的变化可活化AMPK进而发挥心肌保护作用。此外，心脏的自分泌/旁分泌因子也与AMPK的活化密切相关。本文阐述了缺血再灌注发生时，心肌通过自分泌/旁分泌效应活化AMPK的相关蛋白激酶及其部分作用机制。

综述；AMP-活化蛋白激酶；缺血再灌注

单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是一种丝苏氨酸激酶，是细胞应激反应中感知能量变化的感受器，参与维持细胞内的能量稳态[1]。AMPK是由α催化亚基，β、γ调节亚基组成的异源三聚体。每个亚基均含有2～3个亚型，分别由不同的基因编码[2]。α亚基含有重要的磷酸化位点第172位的苏氨酸（Thr172）。缺血缺氧发生时，细胞内三磷酸腺苷（ATP）的浓度降低，二磷酸腺苷（ADP）和单磷酸腺苷（AMP）的浓度升高，AMP/ATP和ADP/ATP的比例升高，AMP与γ3结合可变构磷酸化α亚基中Thr172位点，最终活化AMPK[3]。另有研究发现，缺血缺氧发生时心肌的自分泌/旁分泌效应与AMPK的活化密切相关，其活化过程可能与催化Thr172活化的AMPK上游蛋白激酶相关[4]。活化的AMPK可保护心肌免受损伤，维持心脏正常功能。本文以缺血再灌注发生时，活化AMPK的上游蛋白激酶及心肌自分泌/旁分泌效应活化AMPK的相关蛋白进行综述。

1 AMPK活化的上游蛋白激酶

研究显示，肝脏激酶B1（LKB1），钙调节蛋白依赖型激酶激酶2（CaMKK-2）和转化生长因子β活化蛋白激酶1（TAK1）等上游蛋白激酶通过激活磷酸化Thr172位点而活化AMPK。

LKB1： 心脏中主要的上游激酶是LKB1，LKB1活化需要与它的辅助蛋白Ste20-related adaptor（STRAD）和Mouse protein 25（MO25）相结合。有研究证实LKB1缺失的小鼠心脏AMPKα2活化作用降低，缺血状态时其活化程度也不增加，并伴有含有α2亚基的磷酸化AMPK复合物消失。同时，相比于LKB1正常表达的小鼠，LKB1缺失的小鼠心脏AMPKα1的活化程度明显降低。此外，缺血发生时LKB1缺失的心脏ADP/ATP和AMP/ATP比例升高幅度大于LKB1正常表达的心脏。超声心动图提示LKB1缺失的心脏表现出功能异常，重量减少和心房扩大。因此，LKB1在活化AMPK中发挥关键作用。此外，LKB1缺失可通过调控CaMKK-2/ AMPK通路的活化引起细胞周期停滞[5,6]。

CaMKK-2 ：CaMKK-2在心肌细胞中的表达量相对较低，近期有研究发现它在AMPK的活化中发挥关键作用，CaMKK-2调控的AMPK Thr172位点的磷酸化是Dopachrome tautomerase（DDT）结合至CD74后活化AMPK的关键因子[7]。DDT是CD74的第二个配体，它和迁移抑制因子(MIF)有相同的局部序列和结构同源性，能够通过与CD74结合活化AMPK[8]。

TAK1：有研究从遗传学和生物学角度证明了TAK1在体内外均可活化snf1蛋白激酶，即哺乳动物AMPKα亚基的酵母同族体。另有研究显示，细胞中缺失TAK1可干扰AMPK活化、损伤内源性AMPK基质乙酰辅酶A的磷酸化、并干预AMPK上游激酶LKB1的活化，阻断Thr172位点磷酸化[9]。

2 缺血发生时心肌自分泌/旁分泌因子对AMPK的活化作用

作为细胞内的能量传感器，AMPK可被细胞内腺嘌呤核苷酸的浓度改变所活化，同时也可应答细胞外包括激素、细胞因子、脂肪因子和内分泌/旁分泌因子的各种信号。研究证实，在心脏内环境发生改变时，心脏的心肌细胞、纤维细胞、血管细胞以及祖细胞会分泌多种蛋白，虽然有些导致心肌细胞凋亡、心肌纤维化并诱发炎症反应，但是这些蛋白对维持心脏正常功能、抑制心室重构发挥着关键作用[4,10-12]。这些由心脏分泌的具有保护作用的蛋白统称为心脏激酶（cardiokines）[13]。其中最典型的有卵泡抑素样蛋白1（Fstl1）、MIF、尿皮素2（Ucn2）、C1q/肿瘤坏死因子蛋白家族（C1q/TNF）、转化生长因子β活化蛋白连接蛋白（TAB1）、Sestrin2和成纤维生长因子21（FGF21）。

Fstl1： Fstl1是卵泡抑素家族的一种分泌型糖蛋白，该家族蛋白可与转化生长因子β（TGF-β）相互作用。但是由于Fstl1与卵泡抑素和Fstl3的同源性较低，故而它对TGF-β的调节作用较弱。研究证实，心力衰竭或心肌缺血发生时，血清Fstl1水平上升[14]。此外，Fstl1可抑制因心脏负荷过重引起的心室重构，而这一作用与Fstl1促进心肌细胞中的AMPK通路活化有关[15]。重组人Fstl1蛋白在啮齿动物和猪的缺血再灌注损伤模型中亦可通过活化AMPK以抑制细胞凋亡并抑制心脏炎症反应发挥心脏保护作用[15]。

MIF与DDT：MIF是一种调节炎症反应和免疫应答的巨噬细胞因子。MIF表达在心肌细胞中且受HIF-1α调控，心脏发生缺血再灌注损伤时表达增高。MIF通过两种途径发挥心脏保护作用：首先，MIF通过自分泌/旁分泌效应激活细胞表面受体CD74，活化AMPK，促进心脏对葡萄糖的摄取。MIF缺乏导致心脏AMPK表达减弱以及葡萄糖摄取减少，最终导致缺血再灌注损伤后的心肌损伤。研究显示老龄化的心脏发生缺血时AMPK活性降低，MIF表达降低，而加入外源性MIF可增强缺血诱导的AMPK活化并改善心脏功能。其次，MIF可抑制缺血再灌注时Jun氨基末端激酶（JNK）的活化，而JNK可导致缺血再灌注损伤。MIF缺乏可导致心脏功能障碍，细胞凋亡和JNK在缺血再灌注时的活化增强。以上研究提示在心肌梗死的治疗时可着重于增强MIF-AMPK轴的作用[7]。

然而由于反应时间窗相对较狭窄，尽管研究证实了MIF-AMPK轴在缺血再灌注时的心肌保护作用，其药理作用效果受到了极大的限制[16]。此外，MIF可活化趋化因子受体CXCR4导致心肌收缩力减弱，又可增加严重缺血损伤后的炎症反应[17]。因此，高度选择性的CD74可能会有更大的治疗潜力。研究显示，相比于MIF，CD74缺失将导致更为严重的心脏缺血再灌注损伤[7]。另有研究发现，除了MIF，CD74还有第二个配体DDT，它和MIF有相同的局部序列和结构同源性[18]。DDT在哺乳动物体内缺乏一个酶作用物，可被认为是一种功能残缺的酶。DDT在心肌细胞中高表达，在心肌缺血发生时由心脏分泌[7]。DDT通过结合至MIF的受体CD74以触发CaMKK-2调控的AMPK Thr172位点的磷酸化，进而活化AMPK[7]。作为CD74兴奋剂，DDT相对于MIF显示出更高的选择性，且没有MIF治疗时出现的影响心肌收缩力等副作用[7]。研究显示DDT可减轻小鼠离体心脏和在体完整心脏在缺血再灌注损伤后的收缩功能异常。

Ucn2：Ucn2是促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）家族的一种肽类物质，Ucn2可通过与心肌细胞上CRF2受体紧密结合以发挥缺血再灌注时对心肌保护作用。研究证实，内源性Ucn2可通过自分泌/旁分泌效应活化AMPK，继而磷酸化下游的乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase），增加心肌细胞对葡萄糖的摄取，最终减少小鼠心肌缺血再灌注后的心肌损伤和心功能异常。该过程可被蛋白激酶Cε（PKCε）迁移抑制肽（epsilonV1-2）阻断。外源性的Ucn2也表现出了对离体心肌细胞AMPK通路的活化作用。因此，Ucn2对心肌的保护作用受细胞表面受体CRFR2的调节，并于PKCε迁移密切相关。总之，Ucn2-CRFR2-PKCε-AMPK通路可减轻心肌缺血再灌注损伤，但其中联系PKCε和AMPK活化的机制尚不明确[19]。

C1q/TNF： C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白家族（CTRPs）与脂联素（APN）均属C1q/TNF，该家族成员C-末端都具有与补体C1q高度相似的球形结构域且在C1q/TNF蛋白家族中高度保守，该区域是与其他蛋白或受体发生反应的位点[20]。

心脏的AMPK可被来自tat组织释放入循环血浆中的脂肪因子活化。APN是脂肪因子原型，由脂肪细胞合成并分泌。APN基因敲除的小鼠表现出缺血时AMPK活化障碍，并增加了对缺血性损伤的易感性。相反，腺病毒转染调控APN表达的小鼠AMPK活性增加，且能保护小鼠心肌不受缺血性再灌注损伤。离体细胞的研究证实APN的抗凋亡效应部分受AMPK调控。另有研究证实APN可通过抑制炎症反应，细胞凋亡及氧化应激反应保护缺血再灌注猪模型的心肌[21]。

目前APN在缺血再灌注发生时保护心肌组织的作用机制尚未完全明确，多数研究认为脂联素可能与其特异性受体AdipoR1和AdipoR2结合后发挥生物学效应。另有研究证实由Cdh13编码的T-钙粘蛋白（T-cad）是APN的新受体。T-cad缺失跨膜区而由糖基磷脂酰肌醇附着于细胞膜上，并在心脏中高表达[22]。T-cad通过与APN结合而发挥缺血时的心肌保护作用。研究显示T-cad缺失的APN不能与心肌组织结合，且T-cad缺失与APN缺失一样可加重心力衰竭后的心室重构，并可加大梗死面积。T-cad在APN依赖的AMPK磷酸化中起关键作用。重组病毒转染的APN可减少APN缺失小鼠的心肌重构并缩小梗死面积，并能重新磷酸化AMPK。但是当转染的APN缺乏T-cad时该效应减弱。以上研究证明T-cad可通过与APN结合来激活APN的心肌保护作用[23]。

CTRP9是一种新型脂肪细胞因子，属于CTRP成员之一，CTRP9在进化过程中高度保守，且与APN同源性最高，其C-末端球形结构域的氨基酸序列具有51%的一致性。CTRP9基因敲除小鼠缺血再灌注发生后心肌梗死面积增大，炎性因子表达增加。采用CTRP9因子处理心肌细胞可抑制脂多糖诱导的炎性因子表达，但是当阻断AMPK通路或脂联素受体1（AdipoR1）时该抑制作用消失。CTRP9因子系统性给药可抑制野生型小鼠脂多糖诱导的心功能不全，但是在AMPK通路显性失活或脂联素受体1基因敲除的小鼠中该效应消失。以上研究证明CTRP9可通过脂联素受体1/AMPK通路抑制急性心肌损伤后的炎症反应来保护缺血再灌注损伤时的心肌[24]。另有研究证实CTRP9可通过减少二硫键氧化还原酶类似蛋白（DsbA-L）来抑制内质网应激在糖尿病心脏中发生缺血再灌注损伤时的产生心肌保护作用。研究证实了活化的AMPK可通过抑制内质网应激减少细胞凋亡，从而保护缺血的心肌。但是CTRP9与AMPK在减少内质网应激方面关系如何尚未可知[25]。

网膜素：网膜素是由脂肪组织分泌的一种新的脂肪因子，特异性表达与网膜脂肪组织，包括网膜素1和网膜素2，血液循环中主要为网膜素1。研究显示，将人网膜素系统性应用于小鼠可减少缺血再灌注后的心肌梗死面积和细胞凋亡，同时伴有AMPK的活化增强，而阻断AMPK则网膜素对心肌的保护作用消失。体外培养的细胞中，网膜素可抑制缺氧/再氧化导致的细胞凋亡，这一过程亦可被失活的AMPK阻断。以上研究证明网膜素可通过AMPK通路在发生缺血再灌注损伤时保护心肌组织[26]。

TAB1：丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号转导途径是真核生物中普遍存在的重要信号机制之一， TAB1 所介导的p38α自我磷酸化是MAPK通路活化的重要信号。研究显示，TAB1可诱导p38MAPK自磷酸化，而缺血可促进p38MAPK向TAB1募集以促进缺血心肌细胞对葡萄糖的摄取。此外，TAB1可与AMPK的α2催化亚基相结合，p38MAPK向TAB1/AMPK化合物募集需要AMPK的活化，该过程在AMPK缺失的转基因小鼠中被抑制。因此，TAB1通过与AMPK相互作用诱导缺血心肌中的p38MAPK自磷酸化，以促进p38MAPK活化，并最终促进缺血心肌对葡萄糖的摄取而发挥心肌保护作用[27]。

Sestrin2： Sestrin是一类相对保守的应激诱导型蛋白，Sestrin2是Sestrin家族PA26相关蛋白成员，它能被转录因子p53活化[28]，与细胞生长和存活相关。Sestrin2蛋白在成熟心肌细胞中表达并在缺血发生时表达增多。相比于野生型小鼠，Sestrin2敲除的小鼠在缺血时表现出梗死面积的显著增大。Langendorff灌注心脏模型也证实了相比于野生型大鼠心脏，在Sestrin2基因敲除的心脏表现出明显的缺血后收缩功能障碍。此外，Sestrin2基因敲除的心脏导致AMPK活化障碍，免疫沉淀反应证明了Sestrin2与AMPK的相关性，且与AMPK通路的上游信号LKB1关系密切。因此，Sestrin2作为LKB1-AMPK的连接蛋白，在活化AMPK通路进而保护缺血心肌方面发挥重要作用[29]。

FGF21：FGF家族在调节细胞生长、细胞凋亡等方面发挥重要作用，FGF21可在糖尿病和肥胖人群中高表达，是一个关键的调节因子。此外，FGF21在冠心病合并高脂血症人群中水平升高。近期研究发现FGF21、FGF21受体可表达在鼠科动物和人类心肌细胞中，心脏FGF21在缺氧环境下通过自分泌/旁分泌作用于心脏组织，在心肌缺血时表达量增加。成年大鼠心脏实验证实了FGF21对活化AMPK通路的活化作用。在Langendorff灌注心脏模型中，FGF21可显著增强心肌缺血后心脏保护作用并促进心功能恢复，而阻断AMPK通路可抑制FGF21诱导的心肌保护作用[30]。

总之，活化后的AMPK在心肌发生缺血再灌注损伤时可通过多种途径发挥心肌保护作用。一方面AMPK通过增加心肌对葡萄糖及脂肪酸的的摄取，促进糖酵解等途径维持心肌内的ATP供应以保护心肌。另一方面AMPK可通过调节细胞的功能变化来保护心肌细胞。当心肌缺血发生时，AMPK可诱导细胞自噬移除已经受损的细胞器，例如通过移除功能失调的线粒体可减少心脏内的氧化应激反应[31]。AMPK也可减弱心肌缺血时发生的内质网应激来抑制细胞凋亡。此外，AMPK能够使线粒体孔（mPTP）的开放，缺血再灌注后期mPTP的开放可触发细胞死亡[32-34]。

综上所述，AMPK是介导能量代谢的主要蛋白激酶，AMPK的活化与心肌自分泌/旁分泌作用关系密切，然而其中多数蛋白激酶与AMPK的作用机制尚未完全清晰。鉴于AMPK对缺血再灌注发生时心肌保护的关键作用，AMPK及其相关自分泌/旁分泌机制的阐明将为缺血时心肌保护开辟新途径。

[1] Zaha VG, Young LH. AMP-activated protein kinase regulation and biological actions in the hear. Circ Res, 2012, 111: 800-814.

[2] Hardie DG. AMPK-sensing energy while talking to other signaling pathways. Cell Metab, 2014, 20: 939-952.

[3] Xiao B, Sanders MJ, Underwood E, et al. Structure of mammalian AMPK and its regulation by ADP. Nature, 2011, 472: 230-233.

[4] Tian Y, Morrisey EE. Importance of myocyte-nonmyocyte interactions in cardiac development and disease. Circ Res, 2012, 110: 1023-1034.

[5] Fogarty S, Ross FA, Vara CD, et al. AMPK causes cell cycle arrest in LKB1-deficient cells via activation of CAMKK2. Mol Cancer Res, 2016, 14: 683-695.

[6] Yang H, Sun W, Quan N, et al. Cardioprotective actions of Notch1 against myocardial infarction via LKB1-dependent AMPK signaling pathway. Biochem Pharmacol, 2016, 108: 47-57.

[7] Qi D, Atsina K, Qu L, et al. The vestigial enzyme D-dopachrome tautomerase protects the heart against ischemic injury. J Clin Invest, 2014, 124: 3540-3550.

[8] Merk M, Mitchell RA, Endres S, et al. D-dopachrome tautomerase (DDT or MIF-2): doubling the MIF cytokine family. Cytokine, 2012, 59: 10-17.

[9] Chen Z, Shen X, Shen F, et al. TAK1 activates AMPK-dependent cell death pathway in hydrogen peroxide-treated cardiomyocytes, inhibited by heat shock protein-70. Mol Cell Biochem, 2013, 377: 35-44.

[10] Kakkar R, Lee RT. Intramyocardial fibroblast myocyte communication. Circ Res, 2010, 106: 47-57.

[11] Rohr S. Arrhythmogenic implications of fibroblast-myocyte interactions. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2012, 5: 442-452.

[12] Tirziu D, Giordano FJ, Simons M. Cell communications in the heart. Circulation, 2010, 122: 928-937.

[13] Shimano M, Ouchi N, Walsh K. Cardiokines: recent progress inelucidating the cardiac secretome. Circulation, 2012, 126: e327-e332. [14] Shimano M, Ouchi N, Nakamura K, et al. Cardiac myocyte follistatinlike 1 functions to attenuate hypertrophy following pressure overload. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108: E899-E906.

[15] Shimano M, Ouchi N, Nakamura K, et al. Cardiac myocyte follistatinlike 1 functions to attenuate hypertrophy following pressure overload. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108: E899-E906.

[16] Qi D, Atsina K, Qu L, et al. The vestigial enzyme D-dopachrome tautomerase protects the heart against ischemic injury. J Clin Invest, 2014, 124: 3540-3550.

[17] Liehn EA, Kanzler L, Konschalla S, et al. Compartmentalized protective and detrimental effects of endogenous macrophage migration-inhibitory factor mediated by CXCR2 in a mouse model of myocardial ischemia/reperfusion. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2013, 33: 2180-2186.

[18] Merk M, Mitchell RA, Endres S, et al. D-dopachrome tautomerase (DDT or MIF-2): doubling the MIF cytokine family. Cytokine, 2012, 59: 10-17.

[19] Li J, Qi D, Cheng H, et al. Urocortin 2 autocrine/paracrine and pharmacologic effects to activate AMP-activated protein kinase in the heart. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110: 16133-16138.

[20] Ouchi N, Walsh K. Cardiovascular and metabolic regulation by the adiponectin/C1q/tumor necrosis factor-related protein family of proteins. Circulation, 2012, 125: 3066-3068.

[21] Kondo K, Shibata R, Unno K, et al. Impact of a single intracoronary administration of adiponectin on myocardial ischemia/reperfusion injury in a pig model. Circ Cardiovasc Interv, 2010, 3: 166-173.

[22] Ciatto C, Bahna F, Zampieri N, et al. T-cadherin structures reveal a novel adhesive binding mechanism. Nat Struct MolBiol, 2010, 17: 339-347.

[23] Denzel MS, Scimia MC, Zumstein PM, et al. T-cadherin is critical for adiponectin-mediated cardioprotection in mice. J Clin Invest, 2010, 120: 4342-4352.

[24] Kambara T, Ohashi K, Shibata R, et al. CTRP9 protein protects against myocardial injury following ischemia-reperfusion through AMP-activated protein kinase (AMPK)-dependent mechanism. J Biol Chem, 2012, 287: 18965-18973.

[25] Bai S, Cheng L, Yang Y, et al. C1q/TNF-Related protein 9 protects diabetic rat heart against ischemia reperfusion injury: role of endoplasmic reticulum stress. Oxid Med Cell Longev, 2016, 2016: 1902025.

[26] Kataoka Y, Shibata R, Ohashi K, et al. Omentin prevents myocardial ischemic injury through AMP-activated protein kinase- and Aktdependent mechanisms. J Am Coll Cardiol, 2014, 63: 2722-2733.

[27] Lanna A, Henson SM, Escors D, et al. The kinase p38 activated by the metabolic regulator AMPK and scaffold TAB1 drives the senescence of human T cells. Nat Immunol, 2014, 15: 965-972.

[28] Eid AA, Lee DY, Roman LJ, et al. Sestrin 2 and AMPK connect hyperglycemia to Nox4-dependent endothelial nitric oxide synthase uncoupling and matrix protein expression. Mol Cell Biol, 2013, 33: 3439-3460.

[29] Morrison A, Chen L, Wang J, et al. Sestrin2 promotes LKB1-mediated AMPK activation in the ischemic heart. FASEB J, 2015, 29: 408-417.

[30] Patel V, Adya R, Chen J, et al. Novel insights into the cardioprotective effects of FGF21 in lean and obese rat hearts. PLoS One, 2014, 9: e87102.

[31] Kim J, Kundu M, Viollet B, et al. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1. Nat Cell Biol, 2011, 13: 132-141.

[32] Paiva MA, Rutter-Locher Z, Goncalves LM, et al. Enhancing AMPK activation during ischemia protects the diabetic heart against reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 300: H2123-H2134.

[33] 梁平平, 仲琳, 龚磊, 等. 成纤维细胞生长因子21对内质网应激诱导心肌细胞凋亡的影响及其机制研究. 中国循环杂志, 2017, 32: 279-283.

[34] 刘燃, 宋蕊, 袁丽, 等. 人参皂苷Rg1对心肌细胞的影响及其信号传导机制. 中国循环杂志, 2015, 30 : 1096-1100.

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2016-12-07)

（编辑：常文静）

国家自然科学基金（ 81373590）

100029 北京市，北京中医药大学（王超）；北京中医药大学第三附属医院（赵海滨）

王超 博士研究生 研究方向为中医药防治心脑血管疾病 Email：wangchaozhongyi@sina.cn 通讯作者：赵海滨 Email：haibin999@126.com

R54

A

1000-3614（2017）08-0826-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.08.024