miR-320在乳腺癌组织中的表达及临床意义

程学远，黄忠

（广西北海市人民医院 普通外科，广西 北海 536000）

miR-320在乳腺癌组织中的表达及临床意义

程学远，黄忠

（广西北海市人民医院 普通外科，广西 北海 536000）

目的探讨miR-320在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测108例乳腺癌组织和对应癌旁正常组织中miR-320表达，分析miR-320表达与乳腺癌病理特征的相关性。结果乳腺癌组织中miR-320表达水平低于正常乳腺组织[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。乳腺癌组织miR-320表达水平与乳腺癌TNM分期及淋巴转移有关（P<0.05）；而miR-320表达水平与年龄、绝经、病理类型、肿瘤大小、C-erbB-2表达、增殖细胞核抗原（PCNA）表达、孕激素受体（PR）表达及雌激素受体（ER）表达无关（P>0.05）。结论miR-320在乳腺癌组织中呈低表达，且其表达水平与乳腺癌发生发展密切相关，miR-320可能是乳腺癌特异性诊断潜在标志物和治疗新靶点。

miR-320；乳腺癌；临床病理特征

Abstract:ObjectiveTo evaluate the expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer.MethodsThe expression of miR-320 in 108 cases of breast cancer tissues and normal breast tissue were detected by RT-PCR,and analyzed the correlation between expression of miR-320 in breastcancer,pathological feature and clinical prognosis.ResultsThe miR-320 expression levels of breast cancer tissue were significantly lower than normal breast tissue[(0.58±0.17)vs(1.05±0.21)](P<0.05).The miR-320 expression level was closely correlated with TNM staging and lymph node metastasis(P<0.05),but the miR-320 expression level was no correlated with age,menopause,pathological type,tumor size,C-erbB-2 expression,PCNA expression,PR expression and ER expression (P>0.05).ConclusionsmiR-320 is lowly expression in the breast cancer,and its expression level is closely related with occurrence and development of breast cancer.

Keywords:miR-320;breast cancer;clinicopathological features

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，全世界每年约有130万乳腺癌新增病例，约有50多万患者死于乳腺癌[1]。尽管手术联合同步放化疗治疗早期乳腺癌的长期治愈率可达≥90%，但对于局部晚期及复发转移乳腺癌仍缺乏令人满意的治疗手段[2]。缺乏具有早期诊断及预后判定意义的特异性指标是导致乳腺癌临床诊疗效果欠佳的重要因素。因此，探寻乳腺癌的发病机制，明确其早期诊断及治疗靶点，对于乳腺癌的临床诊疗具有十分重要的意义。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）属于内源性非编码小分子核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其可通过与靶基因信使核糖核酸3’（messenger ribonucleicacid 3’，mRNA 3’）端非翻译区相结合调控靶基因mRNA翻译，从而在转录后水平调控基因表达，并以此参与细胞增殖、分化及凋亡等过程[3]。miRNAs异常表达与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。因此，miRNAs被认为是肿瘤特异性诊断标志物和治疗新靶点。miR-320是一种公认的抑癌miRNA，既往研究显示，miR-320在宫颈癌[4]和结直肠癌等[5]多种恶性肿瘤组织中低表达。但miR-320在乳腺癌组织中的表达及其临床意义尚未明确。本研究旨在探讨miR-320表达水平乳腺癌临床病理特征的关系，以期为乳腺癌的临床诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 选取2014年7月-2016年9月北海市人民医院收治的108例乳腺癌患者。患者均为女性；年龄 27～69 岁，平均（52.35±9.44）岁；所有乳腺癌组织样本均经病理证实为原发性乳腺癌；术前均未接受放疗、化疗等辅助治疗，且有完整临床病理资料。同时取对应癌旁组织（距癌组织边缘≥5 cm）为对照组，所有癌旁组织样本均经病理证实为正常乳腺组织。

1.1.2 试剂与设备 逆转录试剂盒、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（购于美国ABI公司），Trizol试剂（购于美国Invitrogen公司），miR-320、U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 取2 mm3样本组织超声匀浆，随后加入1ml Trizol试剂，吹打均匀后室温静置10 min 后加入 340 μl氯仿，震荡均匀，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上层水相并加入等体积的异丙醇，震荡均匀，室温反应10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，室温放置15 min以彻底晾干，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶解，取1 μl RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，采用Bio-Rad检测RNA纯度及浓度。

1.2.2 逆转录反应 取组织总RNA置于1支洁净PCR 反应管中，1 μl Oligo（dT），RNase Free dH2O将溶液总体积补足至6 μl，混匀，70℃水浴10 min，冰浴3 min，向上述聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应管中依次加入下列试剂，总反应体系为20 μl∶1 μmol/L逆转录特异性引物3 μl、10×RT buffer 1.5 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、50 u/μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase（美国Applied Biosystems公司）1.0μl、20 u/μl RNA 酶抑制剂 0.19 μl、总 RNA 1 μl，加 DEPC 水补至 20 μl。反应条件：16℃反应 30 min，42℃反应 30 min，85℃反应5 s，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。miR-320逆转录引物序列，正向引物：5'-TATTCGCACTGGAT ACGACTCCAGC-3’；反向引物：5'-GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGG-3’。U6逆转录引物序列，正向引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，反向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。

1.2.3 PCR扩增 取一支洁净PCR反应管，反应体系为20μl，冰上依次加入以下试剂：逆转录产物互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）1 μl、引物 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix（美国 Applied Biosystems公司）10 μl，加双蒸水补至20μl。反应条件：95℃反应10 min，92℃反应15s，60℃反应1min，共40个循环。以U6为内参，△Ct值=miR-320Ct值-U6Ct值。miR-320引物序列，正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTG AGA-3'；反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。U6引物序列，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，计数资料用百分数（%）表示，组间比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与正常乳腺组织miR-320表达水平比较

乳腺癌组织中miR-320表达水平低于正常乳腺组织[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。

2.2 乳腺癌组织miR-320表达水平与临床病理特征的关系

miR-320表达水平与TNM分期及淋巴转移有关（P<0.05），miR-320表达水平年龄、绝经、病理类型、肿瘤大小、C-erbB-2表达、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达、孕激素受体（progesterone receptor，PR）表达及雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达无关（P>0.05）。见附表。

附表 乳腺癌组织临床病理特征与miR-320表达水平的相关性 （±s）

病理特征 例数miR-320相对表达量t值P值绝经是48 0.60±0.24 0.197 0.843否60 0.56±0.15年龄≥40岁 66 0.59±0.28 0.049 0.978<40岁 42 0.57±0.14病理类型浸润型导管癌 57 0.55±0.20 0.113 0.924浸润型小叶癌 51 0.60±0.16 TNM分期I、Ⅱ 72 0.68±0.25 3.199 0.035Ⅲ36 0.52±0.13肿瘤大小<2.5 cm 55 0.59±0.20 0.062 0.963≥2.5 cm 53 0.57±0.16淋巴结转移是40 0.51±0.15 3.128 0.038否68 0.66±0.23 C-erbB-2表达+38 0.56±0.25 0.127 0.919-70 0.59±0.16 PCNA表达+76 0.57±0.21 0.058 0.964-32 0.59±0.19 PR表达+71 0.57±0.20 0.225 0.821-37 0.60±0.24 ER表达+73 0.59±0.16 0.186 0.859-35 0.57±0.22

3 讨论

miRNA属于高度保守的非编码小分子单链RNA，并广泛存在于真核生物中。正常生理状态下，机体内miRNA表达遵守严格的组织、时序特异性；但在肿瘤环境下，miRNA往往出现异常表达，并起到类似癌基因或抑癌基因的作用[6]。大量研究证实，乳腺癌中存在多种miRNA的异常表达，提示miRNA参与乳腺癌的发生、发展[7-9]。因此，深入研究miRNA与乳腺癌的相关性，对乳腺癌的临床诊疗具有积极的促进作用。

miR-320定位于人类第8号染色体，是新发现的一类miRNA。近年来研究发现，miR-320失衡表达可促进恶性肿瘤的发生、发展。WU等[10]研究显示，口腔鳞状细胞癌组织中miR-320表达低于正常组织（P<0.05），且miR-320表达水平与肿瘤血管密度呈负相关（P<0.05），而慢病毒载体转染miR-320可抑制腔鳞状细胞癌新生血管生成。WAN等[11]研究表明，结直肠癌组织中miR-320表达低于正常组织（P<0.05），过表达miR-320可抑制结直肠癌细胞HT-29增殖及侵袭，并降低后者对5-Fu和奥沙利铂的敏感性，其机制与miR-320靶向调控叉头框蛋白 M1（fork head box M1，FOXM1）蛋白表达有关。宋成等[12]通过对比宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织miR-320表达发现，宫颈癌组织中miR-320表达低于正常宫颈上皮组织（P<0.05），且miR-320表达水平与宫颈癌临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）。上述研究提示，miR-320在多种恶性肿瘤进展过程中发挥着类似抑癌基因作用，但miR-320在乳腺癌中的作用尚未明确。

本研究结果显示，乳腺癌组织中miR-320表达水平低于正常乳腺组织（P<0.05），该结果与其他肿瘤的表达情况相似[12-13]，提示miR-320低表达可能在某种程度上促进乳腺癌的发生、发展。进一步分析，乳腺癌组织中miR-320表达与乳腺癌临床病理特性相关性发现，TNM分期越高则miR-320表达越低（P<0.05），提示miR-320可能作为抑癌基因参与乳腺癌的进展过程；远处淋巴转移者miR-320表达低于无淋巴转移者（P<0.05），提示miR-320低表达可能促进乳腺癌侵袭及迁移[14]。而miR-320表达与年龄、绝经、病理类型、肿瘤大小、C-erbB-2表达、PCNA表达、PR表达及ER表达（P>0.05），提示miR-320表达不易受个体因素或其他因素影响，其可能是乳腺癌早期诊断、疗效判定和预后评估的潜在指标。但值得注意的是，由于miR-320在多种恶性肿瘤组织中具有高表达，故其诊断乳腺癌的特异性较差。因此，联合其他血清学指标检测可能对于提高miR-320针对乳腺癌的特异性有所帮助。

综上所述，miR-320在乳腺癌组织中呈低表达，且其表达水平与乳腺癌TNM分期及淋巴转移密切相关。miR-320可能是乳腺癌特异性诊断潜在标志物和治疗新靶点。

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Expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer

Xue-yuan Cheng,Zhong Huang
(Department of General Surgery,the People's Hospital of Beihai City,Beihai,Guangxi 536000,China)

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.012

1005-8982（2017）15-0058-04

2016-11-17

北海市本级科学研究与技术开发项目研发类资助（No：201602028）