梭曼啊，梭曼！——纪念周廷冲院士诞辰100周年

孙曼霁

（军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850）

·科海钩沉·

梭曼啊，梭曼！
——纪念周廷冲院士诞辰100周年

孙曼霁

（军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850）

编者按：周廷冲（1917.03-1996.10），生化药理学家，曾任军事医学科学院原药理毒理研究所副所长、基础医学研究所所长，1980年当选中国科学院学部委员（院士）。周廷冲教授1941年毕业于原上海医学院，1947年获英国牛津大学博士学位，1948-1949年先后在美国康乃尔大学、波士顿麻省理工学院从事生物化学研究。中华人民共和国成立后，他和妻子黄翠芬院士怀着满腔爱国热情，毅然决定回国为祖国建设贡献力量，但受到美国移民局的阻挠和刁难。他们冒着被搜捕的危险，乘坐旧金山开往天津的货船，漂洋过海，历时56天回到祖国。谨此在周廷冲院士诞辰100周年之际，本刊特发此文，以兹纪念。

1949年建国初期，我国军事医学研究是一片空白，核化生武器及其医学防护一无所有。当时世界大战和局部战争威胁着年轻的共和国。1951年，中央决定组建军事医学科学院，研究战时大规模特种武器伤害的医学防护。1953年，周廷冲教授奉命调入军事医学科学院原药理毒理研究所，创建药理系。1955年，周廷冲教授与苏联专家凯林开办了我国第一个防化医学训练班。学员们后来都成长为军事医学科学院毒物药物研究所及各军医大学的防化骨干。

神经性毒剂是一类强烈的速杀性胆碱酯酶抑制剂，乙酰胆碱酯酶失活导致神经递质乙酰胆碱在突触间隙大量积聚，持续地作用于下一级神经元或效应器，引起胆碱能系统反应极度亢进，造成严重的神经功能紊乱，甚至死亡。神经性毒剂是美军的制式装备，其中毒机制及防治药物的研究就成为迫切的任务。

20世纪50年代末期，周廷冲教授开创了神经性毒剂生化药理学研究方向。当时，文献中已经报道了丙氟磷和沙林磷（膦）酰化乙酰胆碱酯酶老化的脱烷基现象，磷（膦）酰化乙酰胆碱酯酶的重活化剂（酶的复活剂）也已发现。奇怪的是，重活化剂只要有足够剂量并给得及时，对丙氟磷及沙林抑制的乙酰胆碱酯酶均显示良好的重活化作用，而对梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的重活化作用却怎么也测不来，药物防治研究遇到了极大的困惑。动物实验表明，梭曼是神经性毒剂中最难防治的一种毒剂，梭曼的防治是化学战剂医学防护中国际上公认的尖端课题。药物合成组千方百计地改构重活化剂，药物过筛组努力地筛选中草药，但几年下来，梭曼的重活化剂却始终未能发现。梭曼防治向何处去？一时困扰着大家。周廷冲教授决定从梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶不能被重活化的机制来开展研究。那时国内外对梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶不能被重活化的原因有多种猜测，如转膦酰基学说、空间障碍学说、脱烷基学说和酶变性学说等。国外许多实验室也都为阐明梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化机制而积极地探索着。我们于1961年掌握了同位素示踪技术并提纯了高比活性乙酰胆碱酯酶之后，也向梭曼冲刺。

我们设想，如果梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化也是脱烷基反应，酶分子上的梭曼膦酰残基应该是甲膦酸，而不是特己基甲膦酸。我们将梭曼与乙酰胆碱酯酶在37℃，pH 7.2的条件下相互作用5 min，94%膦酰残基显示以甲膦酸形式存在，只有6%为特己基甲膦酸，大家十分兴奋。进而设想假如分子上确有膦酰基的转变，就必然有一个过程存在，那么其碱水解的降解产物中应该找到残基转化过程的痕迹。我们又想到，一切酶反应都是温度依赖性的，降低反应温度使酶反应过程变慢是否就能够找到这一痕迹？果然，当我们将温度降至20℃时，特己基甲膦酸5 min的相对量达到22%，而0℃时，竟然高达73%。膦酰基的转变在3种温度条件下的时间进程显示了良好的时效性。

以上实验中梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶分子上膦酰基的脱烷基效应是从膦酰残基的相对百分率判断推定的，我们推想温度效应也应该在膦酰化乙酰胆碱酯酶活性的重活化率上得到反映。氯磷啶是沙林膦酰化乙酰胆碱酯酶活性的有效重活化剂，但实验证明它在37℃，pH 7.2条件下对梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶完全没有重活化作用。可是当我们将温度降低至0℃时，氯磷啶对梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶竟然也显现出重活化作用，实验证实了预先的设想。进而我们又设想，如果老化的脱烷基学说是正确的，那么氯磷啶对任何毒剂的未老化的磷（膦）酰化乙酰胆碱酯酶都应该有重活化作用，而对任何毒剂的老化的磷（膦）酰化乙酰胆碱酯酶均应无重活化效果，无论这种毒剂是丙氟磷、沙林、梭曼或者其他。实验完全证实了我们的推断。

在有机磷（膦）毒剂抑制乙酰胆碱酯酶的反应中，膦酰基与乙酰胆碱酯酶活力中心酯解部位中被三联体共轭效应活化了的丝氨酸的羟基相结合，其化学键是C-O-P，而膦酰基的烷氧基与磷原子间的化学键也是CO-P。因而从方法学上可以提出这样的质疑，即碱水解处理样品时，既然可以使前者的C-O-P键高效地断裂，会不会使后者的C-O-P键也被断裂？如果那样，烷基的脱落就可能是人工操作的假象。首先，我们证明用碱处理梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶时98%的膦酰基脱落，说明碱水解对结合在活力中心的C-O-P键是非常有效的。进而我们用不同浓度、不同时程的碱水解反应处理梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶样品。结果显示，均获得了相似的甲膦酸和特己基甲膦酸比率，从而证明了实验方法的可靠性。

我们又注意到，梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的膦酰基如上所述在强碱处理条件下不能发生脱烷基反应，而在37℃，pH 7.2生理条件下却能在瞬间脱去烷基，而且这种脱烷基反应在0～37℃范围内随温度的升高而加快，这似乎意味着脱烷基反应是乙酰胆碱酯酶的一种自家酶催化反应，可能是靠近酶活力中心酯解部位的一个酸性基团在起作用。因此，我们又设计了一组实验，测试梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶在0℃、不同pH条件下被氯磷啶重活化的效率。结果显示，酸性条件可以加速脱烷基反应，而碱性环境则可显著地延迟反应的进程。这也完全符合酶催化反应的性质，实验证实了我们的预想。

我们得出结论，膦酰化乙酰胆碱酯酶随着时间的进程，由一种可以被亲核试剂重新活化的状态转变成不能被重活化的状态的现象叫做老化。老化的实质是膦酰化乙酰胆碱酯酶分子上膦酰残基的脱烷基反应。它是一种单分子裂解反应，即烷氧基团C-O键的断裂。梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶在生理条件下不能被重活化的原因，是由于老化发生太快致使重活化剂来不及发挥其作用的缘故，而梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化反应的实质是酶分子上毒剂残基中特己氧基的去烷基反应。烷基脱落后，氧原子上的负电荷排斥重活化剂的亲核性使之不能进行亲核攻击。

膦酰化乙酰胆碱酯酶中膦酰残基烷氧基团对于重活化剂的亲核攻击的确存在着空间障碍，但它只是未老化的膦酰化乙酰胆碱酯酶活性难以被重活化的原因，而不是老化的原因，因为它不能解释老化的时间依赖性。从而我们否定了空间障碍学说是老化反应的机制。

经过3年的努力，我们对梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的老化机制有了一个比较清晰完整的描述。这一成果比国外文献报道早2年。梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化机制的阐明是防化医学中的重大发展，其理论意义在于揭示了梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化的分子基础，其实用意义在于指出重活化剂研究对老化的梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶将是徒劳的，梭曼中毒的防治应从中毒过程的其他环节加以解决，梭曼抗毒药物研究的方向不是重活化剂，而是抗胆碱药和可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，从而给药物设计及梭曼中毒的防治指明了方向。至今，梭曼中毒防治药物均严格遵循这一原则，药物类型均限定在这一基础框架内。

在弄清了梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化的分子机制后，我们又进行了膦酰化乙酰胆碱酯酶老化规律的研究。实验表明，有机磷（膦）毒剂是一类强烈的乙酰胆碱酯酶抑制剂，膦酰化乙酰胆碱酯酶的形成并不是反应的终结，它可以继续向2个方向转化，即整个膦酰残基的脱落（自动复活）或膦酰基部分残基的脱落（老化）。膦酰化乙酰胆碱酯酶继续转化的多向性是就膦酰化乙酰胆碱酯酶分子的群体而言的，对某一个膦酰化乙酰胆碱酯酶分子来说则只有一种可能。群体中哪些分子走向老化，哪些分子走向自动复活是随机的。在理想的体系中，所有膦酰化乙酰胆碱酯酶分子的机会是均等的。同系结构中，膦酰化乙酰胆碱酯酶分子朝哪个方向转化主要取决于膦酰残基上烷氧基团的结构，即膦酰化乙酰胆碱酯酶的内部因素，而体系中的环境因素只是变化的条件。去膦酰基化反应（自动复活）及脱烷基反应（老化）是两个相对独立发展的过程。不同的膦酰化乙酰胆碱酯酶发展的速度相差悬殊，发生频率高的反应是转化的优势方向，发生频率低的是劣势方向。去膦酰化反应的优势可以接近100%，如甲氟膦酸正丁酯膦酰化乙酰胆碱酯酶，而劣势者可趋于零，如梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶。多数有机膦毒剂则处于中间的地位。

我们系统地研究了梭曼及其类似物与膦酰化乙酰胆碱酯酶老化反应间的规律性，揭示了毒剂残基中烷氧基团结构在膦酰化乙酰胆碱酯酶老化反应中的独特地位。发现氟甲膦酸酯系列中，烷氧基团的化学结构对老化速度影响甚大。α甲基取代促进老化的效力大于β取代者，而α和β甲基同时取代则有显著的协同效应。可以得出结论，α碳原子上1个甲基取代，β碳原子上3个甲基取代时，最易于老化的发生。特己氧基是促进老化的最佳基团，梭曼是此系列毒剂中利于老化发生的最佳结构。进而我们想到，如果这一结论是真实的，那么凡是有特己氧基的甲膦酸酯类有机磷（膦）毒剂所形成的膦酰化酶，在生理条件下将都会迅速地发生老化，实验完全证实了这一推断。这些实验结果的理论意义在于阐明了神经性毒剂化学结构与膦酰化乙酰胆碱酯酶老化之间的规律性，加深了对有机膦毒剂结构与性质的认识。其实用意在于，根据膦酰化乙酰胆碱酯酶老化的规律性预见一些像梭曼一样迅速地使膦酰化乙酰胆碱酯酶老化的未知神经性毒剂，为新毒剂的追踪提供线索。

我们在梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶难以被重活化的研究中，还考虑到中毒机体内存在“过剩的”游离毒剂的可能性。果如所料，大鼠在1个致死剂量以上中毒时，脑和膈肌中均有游离毒剂存在，表现在对外加乙酰胆碱酯酶的抑制。剂量愈大，游离毒剂愈多。梭曼中毒时的游离毒剂比等致死剂量的沙林及塔崩中毒时多，显示了梭曼的特殊性。游离毒剂的发现，从作用机制上给神经性毒剂毒理学增添了新的内容，给中毒防治及解毒药物的研究提出了新的启示，乙酰胆碱酯酶的再抑制可能是膦酰化乙酰胆碱酯酶难以恢复活性的又一原因。十多年后，国外文献才提出了毒剂库的概念。

根据酶的催化原理，酶具有同时催化正向和逆向反应的性质，我们又研究了神经性毒剂酶促合成的可能性。发现G类毒剂，如梭曼及沙林的水解产物氟离子和甲膦酸酯，在试管内有外加乙酰胆碱酯酶存在的条件下，可被G类毒剂水解酶催化重新合成毒剂，表现在对外加乙酰胆碱酯酶活性的严重抑制。我们在国外发表后，被认为是G类毒剂中毒机制研究中又一个重要的发现。这一实验结果，国外迄今没有报道。

光阴荏苒，斗转星移，与梭曼打拼的这一段历史不觉已离去了几十年。周廷冲院士已经仙逝，那时一块儿为梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶老化机制研究战斗拼搏的同志也都年逾古稀，你们还记得那些苦思冥想又兴高采烈的时光吗？今天，我们已经能用生物药物预防比格犬6个致死量的梭曼中毒，并将1个致死量梭曼中毒的预防时程提高到了7天。第二代生物药物抗毒研究也在规划之中。这是自1958年周廷冲教授提出A70生物制剂后，我们取得的最新进展。如果周廷冲老师能听见这些喜讯该是多么地欣慰啊！

今天，在这里写下这篇回忆性的科技散文，纪念周廷冲老师对我们的指导和引领，以及与大家建立的深厚的战斗友谊，以寄托我们的怀念。

（本文编辑：齐春会）

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.03.001

：1000-3002-（2017）03-0207-03

2017-02-16接受日期：2017-03-16）