甘南牦牛源大肠杆菌的分离鉴定

董艳娇，马永生，杨丽艳，叶 泥（甘肃民族师范学院化学与生命科学系，合作 747000）

甘南牦牛源大肠杆菌的分离鉴定

董艳娇，马永生，杨丽艳，叶 泥
（甘肃民族师范学院化学与生命科学系，合作 747000）

大肠杆菌病是一种常见的人畜共患传染病，其在甘肃甘南也有流行。为分离鉴定甘南牦牛源大肠杆菌并探究其致病性，采集甘南牦牛新鲜腹泻粪便50份，进行营养琼脂培养基培养、选择培养基分离纯化和生化试验鉴定。结果表明：27株分离株的形态染色、培养和生化特性符合大肠杆菌的特征；对分离株进行动物试验，表明4株具有致病性。最后结合试验结果和流行病学调查讨论了牦牛大肠杆菌病存在的原因，并提出了相应的防治措施，以期减少牦牛大肠杆菌的感染和流行。

牦牛；大肠杆菌；分离；鉴定

大肠杆菌是人和温血动物肠道中正常的菌群成员之一，但在特定条件下其某些血清型可引起大肠杆菌病，且该病是一种常见的人畜共患传染病。引起大肠杆菌病的致病性大肠杆菌主要有6个型，各种动物均可感染，以幼畜（禽）感染最为严重，导致其发生严重腹泻和败血症，甚至死亡。该菌能通过患病动物的肉、乳及其排泄物和污染物传播给人，引起腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征等，严重者可致死［1］。

牦牛感染致病性大肠杆菌病主要以高热、食欲减退、肠炎、消瘦为主要特征，严重时引起败血症和死亡，特别是犊牛；部分牛还出现呼吸困难、关节肿大、结膜潮红；怀孕母牛流产、早产、产弱胎［2］。目前在印度、西藏、四川、青海等部分地区已有牦牛大肠杆菌病的研究，但甘南牦牛大肠杆菌病的研究尚未见报道。牦牛是甘南群众不可缺少的生产、生活资料，存栏数87万头以上，占全州牲畜的30%左右，占全省牦牛的85.19%［3］。大肠杆菌病为甘南牦牛常见多发病，是造成牦牛腹泻的主要原因之一，且具有较高的发病率，其不仅直接降低牦牛的生产性能和畜产品的质量，还对畜牧业经济发展和公共卫生安全带来隐患。因此，笔者等进行甘南牦牛源大肠杆菌的分离鉴定，以期为大肠杆菌病的监测、防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

采集于甘南地区牦牛新鲜腹泻粪便50份。

1.2 实验动物

清洁小白鼠，购自甘肃天鸿元有限公司。

1.3 主要耗材

微量生化管购自杭州微生物试剂有限公司，营养琼脂、营养肉汤、麦康凯、伊红美蓝、SS琼脂、三糖铁斜面、明胶液化等培养基和二乙酰、甲基红、枸橼酸钠、吲哚及革兰氏染液等试剂均自行配制。

1.4 大肠杆菌的分离纯化

1.4.1 培养基及试剂的配制 培养基及试剂均参考文献［4］配制。

1.4.2 稀释检样 称取1 g牦牛新鲜腹泻粪样，依次制成10-1、10-2、10-3的稀释液。

1.4.3 细菌的培养分离 将稀释检样分别接种到营养琼脂培养基上，涂布均匀，并做平行及对照，37℃培养24 h，挑取疑似单个菌落于玻片上，进行革兰氏染色并镜检。

1.4.4 大肠杆菌的纯化 挑取疑似单个菌落，接种于麦康凯培养基上，37℃培养24 h，选取红色菌落接种于伊红美蓝培养基上，相似条件培养，挑取黑色菌落到麦康凯培养基中继续纯化。最后接种于SS琼脂培养基，观察培养结果。

1.5 大肠杆菌的生化鉴定

用接种环挑取纯化好的菌落分别接种到三糖铁斜面培养基、明胶培养基、乳糖、葡萄糖、甘露糖、枸橼酸盐、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、木糖、L-鼠李糖、氧化酶、微量生化管、蛋白胨溶液、葡萄糖蛋白胨溶液、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中培养，具体操作及结果判定参照文献［4］。

1.6 动物致病性试验

1.6.1 大肠杆菌悬浮液的制备 将纯化好的菌落接种于5mL的普通肉汤培养基中，37℃振荡培养5 h，菌液分装于离心管中，2 500 r/min离心10min，去上清液，用生理盐水吹打离心，去上清液，重复一次，然后加入2mL的生理盐水，保存备用。

1.6.2 动物致病性试验 将试验小鼠随机分组，每组2只，除一组腹腔注射0.2mL营养肉汤作为对照，其余均注射0.2mL菌悬液。隔离饲养1周，连续观察小鼠的临床症状，并对死亡小鼠进行解剖，记录病变，后取少许病料做回归鉴定。

2 结果

2.1 培养特性及形态特征

挑取营养琼脂培养基上形成凸起、表面光滑、半透明、乳白色、中等大小的菌落，革兰氏染色镜检可见短粗、两端钝圆、多数单个存在，少数成双排列的阴性红色短杆菌；将其接种到麦康凯琼脂培养基上可见扁平、边缘整齐、表面光滑的红色菌落。将红色菌落接种到伊红美蓝琼脂培养基上可见黑色带有金属光泽的菌落，将黑色菌落再次接种到麦康凯琼脂培养基上二次纯化后接种SS琼脂培养基，细菌不生长或生长不良。经以上分离纯化，确定27株分离菌符合大肠杆菌的培养和形态特征。

2.2 生化鉴定结果

纯化的27株分离菌均能发酵葡萄糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖且产气，41%发酵蔗糖个别产气，88.9%发酵山梨醇，85.1%发酵木糖和L-鼠李糖，92.6%的菌株吲哚反应阳性，74.0%菌株甲基红反应阳性，二乙酰试验、枸橼酸盐、氧化酶、明胶液化反应均为阴性。综合培养、形态和生化鉴定结果，27株分离株基本符合大肠杆菌的特征，分离率54%。

2.3 动物试验

将分离菌株的菌悬液接种54只小鼠后，12 h开始发病，35只小白鼠表现行动缓慢、精神萎靡、被毛粗乱竖起、发抖、饮食量减少、肛门周围粘有黄色腹泻粪便。24 h开始死亡1只，至48 h共死亡4只。对死亡小鼠进行解剖，表现败血症和肠炎，发现其胸腔有积液，肠肿胀部分发黑或呈土黄色，肝脏、肾脏、肺脏为黑红色并伴有出血点，心脏有黑点。取其心、肝、肺、肾、肠黏膜上的微量血液或部分结构研磨进行镜检、分离培养，均可见大肠杆菌。72 h内未死亡的小鼠行动逐渐敏捷、食欲增加，1周后剖检，未见病变。对照组小鼠在整个试验过程中未见异常。结果表明，27株分离菌中有4株具致病性，小鼠发病率64.8%，死亡率7.4%，致病菌的分离率8%。因此，致病性大肠杆菌在牦牛腹泻粪便的分离率较高，是引起甘南牦牛腹泻的病因之一。

3 讨论

流行病学调查显示，甘南牦牛大肠杆菌病多呈散发性或地方流行性，无明显的季节性，以冬春季节易多发，该病以1～4月龄的犊牦牛最易感，其次是母牦牛，公牦牛感染少，多呈隐性经过。该病的发病率和死亡率分别为8%和2%，既是原发性疾病，又可继发多种疾病，如大肠杆菌感染可以继发牛乳腺炎，对牛乳的产量、质量及乳汁凝固都有一定的影响［5］。

3.1 大肠杆菌病的致病机理及在当地普遍存在的原因分析

致病性大肠杆菌经由污染的饲料、饲草、饮水及患畜的乳、肉等进入宿主的消化道或呼吸道，其通过粘附素、定居因子等粘附和定居在宿主呼吸道和消化道黏膜上，通过侵袭因子、肠毒素、类志贺毒素、Vero毒素、强毒力岛、铁获得系统等毒力破坏宿主免疫系统的功能，从而在体内生长繁殖，增强其毒力而致病［6-7］。其外膜蛋白F结构和产生的生物膜、质粒等也利于大肠杆菌的生存，逃避抗生素药物的作用［8-10］。由于甘南农牧民牦牛养殖饲养管理方式传统粗放，疫病防治意识薄弱，防疫条件力量有限，加之受当地特殊的气候环境、应激因素和抗生素滥用等原因诱发了大肠杆菌的强致病机能，使得大肠杆菌病在甘南普遍存在。

3.2 大肠杆菌病的防治措施与建议

（1）加强饲养管理。注意饲料营养配比均衡，进行适当补饲，补充维生素和微量元素等以提高机体抵抗力；搞好牦牛圈舍的清洁及环境卫生工作，定期消毒；注重检疫，对有腹泻症状的病畜隔离治疗；避免过度惊吓、劳役、驱赶等减少牦牛应激因素，降低诱发因素，防止大肠杆菌的交叉及垂直感染，减少牦牛大肠杆菌病的传播。

（2）建立长期的疫病监测机制，明确甘南牦牛大肠杆菌病原血清型，筛选本地流行的优势血清型制作大肠杆菌灭活苗，制定合理的免疫程序进行预防接种，增强机体抵抗力。同时，加大新型疫苗的开发，如efa-1'的DNA疫苗、肽疫苗、壳聚糖纳米粒子、重组大肠杆菌志贺菌素、新型疫苗抗原组合等。已有的研究表明，上述新型疫苗对预防大肠杆菌病有一定的潜在作用［11-15］。

（3）研究致病性大肠杆菌病原血清型的相关毒力因子、基因结构和代谢等，了解其具体的致病机制，以探索研究降低其毒力的措施。

（4）研究新型药物或新型治疗剂，控制抗生素的使用，避免耐药性的产生。开发中草药配伍制剂，如黄芩、黄芪、石菖蒲、陈皮、甘草、苍术等中草药提取物的合剂［16］，同时尝试红景天、藏木香、柴胡、翼首草、虫草等藏药制剂的开发；此外，有资料显示，MJ1噬菌体可抑制细菌的增殖，异硫氰酸酯可影响大肠杆菌的细胞和毒力形成，405 nm紫色光可抗β-内酰胺抗性大肠杆菌，NO能降低大肠杆菌持久复发性感染的发生率，对这些药物或治疗剂进行充分研究，可发挥其预防和控制大肠杆菌的潜在性能［17-20］。

（5）加大动物微生态制剂的开发与研究。丁酸梭菌、人源型乳酸杆菌干酪乳杆菌和多粘类芽孢杆菌等一种或混合益生菌添加剂均可抑制致病性大肠杆菌［21-23］。也可通过添加血浆免疫球蛋白和抗菌肽，减少腹泻性疾病的发生和提高抵抗力［24-25］。

4 结论

综上表明，甘南牦牛存在致病性大肠杆菌感染。因此，要充分研究牦牛源性大肠杆菌的致病性及其与宿主、环境之间的相互作用，做好该病的流行病学调查、疫情监测和疫病防治等相关工作，以更好地控制疫病，减少其流行和蔓延。

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《中国草食动物科学》期刊采编系统正式上线运行

为了适应期刊网络化和数字化的需要，《中国草食动物科学》杂志建立了期刊采编系统（网址为http://cycz. cbpt.cnki.net），已于2016年4月1日正式上线运行。该系统包含网刊发布系统、作者在线投稿系统、专家在线审稿系统、编辑在线采编系统等。通过作者在线投稿系统，作者可远程在线提交稿件，不用打电话即可了解稿件实时状态，实现稿件信息自动登记；在专家在线审稿系统中，专家登陆系统或通过邮件在线审稿，可加快审稿速度、缩短审稿周期；通过编辑在线采编系统可对稿件的基金项目、行业领域、作者单位、引文情况进行全方位的统计与分析。

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咨询电话：0931-2115279

Isolation and Identification of Escherichia coli from Gannan Yak

DongYanjiao，Ma Yongsheng，Yang Liyan，et al
（Department of Chemistry and Life Science，Gansu Normal University for Nationalities，Hezuo 747000，China）

yak；Escherichia coli；isolation；identification

S858.23

A

2095-3887（2017）01-0040-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.01.012

2016-12-06

甘肃省教育厅高等学校科学研究项目（2015A-155）；甘肃民族师范学院校长科研基金项目（14-15）

董艳娇（1982-），女，讲师，硕士，主要从事动物疫病研究。

Abstrace：Colibacillosis is a common zoonotic infectious disease which is epidemic in Gannan. In order to separate Escherichia coli from Gannan yak and explore its pathogenicity，50 samples of fresh diarrhea feces from yak were cultured by nutrient agar medium，isolated and purified by selective medium，identificated by biochemical tests.The morphology strain，culture and biochemical characteristics of 27 strains were consistent with E.coli and four strains were pathogenic by animal tests.At last，to analysis the cause of the Colibacillosis combined with experimental results and epidemiological investigation，the prevention and treatment measures for reducing the infection and epidemic of E. coli in yak were put forward.