张苗 张玲莉 雷乐 李慧 邹军
1. 上海体育学院运动科学学院,上海 200438 2. 上海体育学院发展规划处,上海 200438
目前,人口老龄化问题日益严重,由此引起的骨质疏松的发病率逐年增加,已成为全球性的医疗卫生问题[1]。骨质疏松的发病多由于破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成而造成的一种骨代谢性疾病[2]。骨形成的过程包括骨吸收和骨形成,其中骨形成主要依靠成骨细胞,成骨细胞(osteoblast, OB)来源于骨髓的间质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSC),首先由BMSC定向分化为骨祖细胞,然后分化为成骨细胞前体,最后分化为成骨细胞[3]。成骨细胞在骨形成中经历成骨细胞的增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段[4]。而骨吸收则是依靠破骨细胞(osteoclast, OC)[5],破骨细胞源于造血源性单核细胞前体细胞融合而成,细胞因子RANKL(receptor activator of nuclear factor-KB ligand)和多肽生长因子CSF-1(M-CSF)诱导分化,经过单核OC的分化、融合为多核OC并活化、生存和附着,发挥骨吸收的功能[6]。骨形成与骨吸收二者共同维持骨骼内动态平衡。
骨骼的动态平衡受到多种因素的影响,其中日常生活中产生的机械刺激是影响骨代谢的重要因素,成骨细胞具有感受器和效应器的作用,进而影响下游的信号转导过程[7]。由于不同的应力会对成骨细胞的形态、基因的表达等方面产生不同的影响,因此本文从微重力、流体剪切力、压应力、牵拉力方面具体阐述对成骨细胞的影响。
微重力是指物体处于失重状态,与完全失重状态非常接近,可称为“零重力”。太空就是一种微重力环境,因此微重力的研究多数为了太空事业的发展。但是由于太空飞行的复杂性,以及样本量少的原因,常采用人体卧床实验和动物尾部悬吊实验来模拟微重力环境,进而来研究微重力环境对于骨量的影响[8],也用离心装置来模拟微重力研究对成骨细胞的影响[9]。
张晓铀等[10]通过回转器对人的成骨细胞周期变化的研究发现,失重情况下,细胞的增殖数目均低于正常重力组,失重情况下G1期细胞数目显著增多,而S期与G2+M期数目显著下降。Yan等[11]实验证明细胞在模拟微重力48 h细胞增殖减少,且在G2/M 期阻滞,细胞凋亡增加。在相关航天飞行的研究发现,通过对MG-63成骨样细胞的微重力的培养发现Ⅰ型胶原α1链、sBAP和sOC的基因表达水平均降低,表示了微重力对成骨细胞分化的抑制作用[12, 13]。失重或微重力使成骨细胞的生长缓慢,由间质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)分化的成骨细胞数量也相应减少,成骨细胞的细胞骨架的纤维含量下降[14]。王冰等[15]研究表明,成骨肉瘤细胞在抛物线飞行时,细胞的粘附面积降低,细胞的粘附斑识别能力降低;但是当细胞长时处于失重环境时则会粘附功能降低。有研究发现,平均每月太空飞行骨量丢失2%[16,17],造成的骨量丢失与长期卧床和老年性骨量丢失相同,主要表现在骨形成减少[17-19]。孙怡宁等[20]研究表明,成骨细胞在微重力环境表现出粘附斑数量和面积减少、分布异常、肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架的组装和分布异常。在姜黄的根茎中提取出的天然酚醛树脂——姜黄素(一种有效的抗氧化剂以及自由基清除剂),辛茂源通过控制重力、微重力和姜黄素三个实验条件证实了微重力使成骨细胞的RANKL和骨保护素(osteoprotegerin, OPG)含量、RANKL/OPG比值均明显升高,维生素D的基因表达水平降低,蛋白表达量减少,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性降低,血浆抗酒石酸酸性磷酸酶(tartratercsistant acid phosphatase, TRAP)活性升高,成骨细胞数目增多,并证实了姜黄素可以减弱微重力对骨形成的抑制作用。苏嘉霖等[21]在实验中选取1 d的SD乳鼠的颅骨成骨细胞原代培养,分为正常重力组、微重力组和微重力+降钙素组,培养72 h后发现,与正常重力组比较,微重力组和微重力+降钙素组的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、OCN、ALP 基因表达均下降,微重力+降钙素组较微重力组基因表达则增加。
流体剪切力简单来说就是将流体看作是一层层在流动,相邻层之间就会存在摩擦力,那这种流体之间形成的摩擦力可看作流体剪切力。
Reich等[22]认为流体剪切力在骨重建中为重要的中介作用。Sakai等[23]研究发现,生理水平的流体剪切力作用于人成骨肉瘤样细胞(SaOS-2),IGF-1活性在3 h后表达量增加3倍,同样的IGF-β1的蛋白表达在24 h后表达量增加了3倍,生理水平的流体剪切力作用于阳离子通道诱发SaOS-2细胞的TGFβ1 mRNA表达增多,进而促进骨形成。Liegibel等[24]适当的流体剪切力可促进细胞分化的属性,如ALP活性、纤连蛋白、纤连蛋白受体的表达量增加,成骨细胞的前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和TGFβ1 基因表达也增加。Cheng等[25]发现,流体剪切力使成骨细胞样细胞系(MLO-Y4)细胞树突长度增加,改变成骨细胞形态学特征和缝隙连接蛋白的再分配。同时,流体剪切力会增加成骨细胞的增殖,已有研究表明,ERK5对成骨细胞增殖至关重要[26],但是流体剪切力通过激活ERK5促进成骨细胞增殖的确切机制了解甚少。Bin等[26]对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)施加流体剪切力1 h或使用ERK5高度抑制剂,结果显示,1 h的流体剪切力促进成骨细胞增殖,而加入ERK5的高度抑制剂可明显抵制流体剪切力的作用。Riquelme等[27]将流体剪切力加载于成骨细胞样细胞系(MLO-Y4),发现流体剪切力可打开释放PGE的门户通道Cx43链接蛋白,通过激活ERK进而影响骨代谢。已有实验表明,流体剪切力可能是通过上调ERK5-AKT-FoxO3a信号通路[26]、Wnt/β -catenin信号通路[28]、PI3K/AKT/mTOR信号通路[29]和 Galphaq -ERK5信号通路[30]的表达,促进成骨细胞的增殖,进而促进骨形成。
机体自身重力以及日常活动中负重会对骨骼产生压力刺激,而这种刺激的普遍性使它一直是研究者研究的重点,尤其是在口腔研究领域。研究者离体条件模拟成骨细胞感受的压应力,可分为静力性压应力和动态性压应力、单轴和双轴压应力等,压应力的不同对成骨细胞的影响也不同。
Owan[31]和Frost[32]等提出细胞受力大小使用细胞应变量(μstrain)来表示细胞受力值。Frost等[33]实验发现,应力值1500~3000μstrain可以促进骨重建过程,增加骨量;当小于100~300μstrain时,骨量减少;大于5000μstrain时,则会造成骨骼骨折。李明黎等[34]使用动静态的压应力刺激大鼠的骨髓间充质干细胞,检测表明成骨细胞数量增多,并且动态的作用效果更加明显,速度更快;静态压应力诱导破骨细胞生成的作用更明显。任可等[35]使新西兰兔的单侧肱骨造成骨折,以天鹅记忆接骨器内固定,在骨折端形成持续的动态压应力,结果显示这种持续的动态压应力上调COX-2、PGE2和cAMP这一信号通路的表达,促使成骨细胞分化成熟,进而促进骨折愈合。曹阳等[36]对人成骨细胞(MG-63)施加单轴牵张应力和压缩应力,且添加低剂量的细胞松弛素 D后,ERK的磷酸化水平低于基态,与单纯压力组相比差异更加明显。米晓晖等[37]基于成骨细胞是感受应力刺激的效应器,并转化为细胞内化学信号的结论,借助其自行开发设计的四点弯曲体外细胞加载装置进行实验,对成骨样细胞株(MG-63)加压,随着压应力的增加,开始成骨细胞表现促进,当超过生理水平,细胞脱落死亡增加。Zhong等[38]对MC3T3-E细胞压缩和拉伸5 h,细胞生长良好,通过激光扫描共焦显微镜观察到经过5个小时压缩的细胞,微丝呈现无序排列,细胞形态加厚,变短;压缩组比核因子k B催化剂配体受体比例明显降低,Wnt10b和Lrp5基因表达增加较小。曹小波等[39]体外培养SD大鼠髁突软骨下骨原代成骨细胞,对细胞加压即刻、6、12、18、24 h后,与对照组比较,观察细胞的增殖和凋亡情况,发现实验组的S期细胞百分比增加,凋亡指数在即刻时指数降低,在6 h后指数逐渐恢复,因此适当的压应力早期能提高成骨细胞的增殖能力并抑制凋亡,促进骨形成。
在运动或日常体力活动时,肌肉会对骨骼产生不同程度的牵拉,骨骼的应力传导系统对牵拉做出反应。人体内的牵拉刺激可分为动态和静态牵拉,也可以分为循环与持续的牵拉刺激,体外模拟不同牵拉刺激使成骨细胞产生了不同的反应。
冯雪等[40]体外培养人成骨样肉瘤细胞Saos-2,对数生长期后对细胞于二维方向上施加牵拉力,牵拉频率为每分钟12次,加载强度使细胞平均变形12 %,加载 12 h后,发现细胞变为多角形,贴壁生长状况良好。曹阳等[36]对人成骨细胞MG-63施加单轴牵张应力和压缩应力,0.5Hz 4000μstrain 5 min,牵拉力促使成骨细胞骨架中黏附斑复合物形成后,酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, TPK)活化,使TPK的转导通路激活。Zhong等[38]对MC3T3-E细胞施加拉伸5 h后,细胞生长良好,微丝导向相互平行,通过激光扫描共焦显微镜观察到经过5 h牵拉的细胞,细胞的形态比空白对照组更薄和更长, 1、3、5 h期间拉伸组Wnt10b和Lrp5基因表达增加,比核因子k B催化剂配体比例增加。Ngan等[41]对牙周成纤维细胞和成骨细胞株(MC3T3-E1)进行拉伸,观察到这两种细胞的前列腺素E和白细胞介素-β1表达量增加,成骨细胞数量增加速度较慢。Adachi等[42]体外培养MC3T3-E1,对细胞进行牵拉,使细胞变形,使用玻璃微针观察到细胞膜的钙离子通道减少。Arai等[43]循环拉伸MC3T3-E1细胞,观察到α1 mRNA的表达水平增加3倍。 Neidlinger-Wilke等[44]对成骨样细胞加载牵拉力和循环压力,当施加相当于1%压力的牵拉力时,成骨细胞增殖显著增加,但碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶活性在循环压力无显著影响。Ziambaras等[45]对成骨细胞加载牵拉力,同时使用降落伞试验观察染料在质膜中扩散的情况,得出循环拉伸增加交界的差距,成骨细胞通过调节细胞的Cx43的胞内定位来完成二者之间的通信。
机械刺激在细胞、细胞膜、细胞基质三者构成的结构中传导,主要依靠细胞骨架实现刺激的传导,使细胞外信号(机械力)转导为细胞内信号。成骨细胞可感受体内多种机械刺激,利用体外培养成骨细胞并施加各种机械刺激,并观察对其的影响。
通过实验室模拟失重研究太空飞行中飞行员骨矿丢失,流体剪切、压应力和牵拉力在口腔医学研究中较集中。其中模拟微重力刺激使骨微细结构改变,骨矿化降低;适当的流体剪切力、压应力、牵拉力会促进成骨细胞的增殖,调节细胞的周期,改变细胞的形态,上调骨形成的进程,从而增加骨量。一旦刺激强度超过成骨细胞可承受的生理水平,则使细胞凋亡增加,减弱骨形成过程。因此需要严格控制刺激的强度、频率以及加载的时间,观察细胞的增殖,分化,凋亡,以及基因表达水平的变化。
在体育活动中,成骨细胞感受到各类型的机械刺激,但之前的研究多数集中在机械刺激对成骨细胞的影响,对于破骨细胞的研究则相对较少。现实中机械刺激对机体的影响非常复杂,受到多种因素的影响,因此大部分研究为离体实验,而在体的实验则少之又少,没有通过实验来证明机械刺激对骨代谢的影响。因此通过分别阐述这几种机械刺激对成骨细胞的影响,为运动预防和治疗骨质疏松和骨折提供更多的理论基础,也为更加深入的研究运动对成骨细胞的影响的机制提供依据。