软骨组织工程中支架材料研究的新进展

吴琪，亓建洪

软骨组织工程中支架材料研究的新进展

吴琪，亓建洪

关节软骨损伤是骨科较为常见的一种疾病。目前，骨软骨缺损的处理方法主要有自体移植、微骨折术、软骨下骨钻孔术和自体软骨细胞移植[1-2]，这些方法都有各自的局限性，均不能完全满足临床以及患者预后的运动要求。20 世纪90 年代，组织工程的概念第一次提出，这是一个综合工程学与生命科学的跨学科领域，其目的是开发生物替代品，修复、维持与改善组织的功能，甚至重新打造整个器官。随着时代的发展和科技的进步，组织工程技术发展迅速，并应用于软骨的修复，为软骨损伤患者的治疗带来了新的希望。成功的组织工程，一定离不开生物材料学科的发展。再生具有不同特性的生物组织，材料的选择至关重要。在软骨组织工程中，由生物材料构成的支架用以支持细胞的贴附和生长，对软骨的修复起着载体的作用，影响种子细胞的生物学行为和培养效率，决定着移植后移植物能否与机体很好地融合、适应，能否较好地修复软骨，因此软骨组织工程支架在组织工程软骨中起着至关重要的作用。近年来，支架的发展也很迅速，目前新的支架材料的开发主要侧重于材料的生物学特性，新的材料不但要能作为支架，还要能与细胞相互作用，诱导细胞迁移、扩增、定向分化。制备支架的方法及微观控制方面也在不断地更新技术，最终目的都是用最接近天然生化特性和生物力学特性的组织来填补缺损，以期帮助患者恢复关节的部分乃至全部运动功能。本文总结近年来组织工程软骨支架材料方面的文献，对支架材料的最新研究进展作一综述。

1 软骨组织工程支架材料的性能要求

在软骨以及大多数的天然组织中，细胞都被一种特殊的物质所包裹，这种物质就是具有 3D 形态的细胞外基质，这种 3D 形态由非常复杂的纳米级网状纤维构成，形成一种高度组织化的微环境，承载着细胞之间的通讯、氧气与营养物质的转运、废物的排出和细胞的新陈代谢等功能，且这种环境是极化的，其内容物的运动方向也是一定的。软骨组织工程原理和技术主要是将活细胞通过某种方式与支架载体合起来，在支架材料逐渐降解的同时，细胞在支架上增殖、分化并产生出新的组织和器官[3]。由此可见，支架在软骨组织工程中起着非常重要的作用，对于支架的仿制，要求支架要尽量接近软骨原本生存的微环境，具有更好的仿生性，主要应满足以下几个方面：①一定的空间结构：为种子细胞的生长提供支持的空间结构，引导构建出软骨的基本轮廓。②适宜的生长环境：为细胞提供有益的生长环境，帮助细胞黏附，辅助细胞迁移，促进细胞增殖与分化。③组织相容性及降解率：软骨组织工程支架材料的选择必须考虑到软骨修复的特殊要求，应当具有良好的生物相容性并具有与软骨生长速度相匹配的降解速度。④机械性能：支架同时也应当具有一定的机械强度以维持相应的组织轮廓与体积。⑤孔隙率：能够模拟软骨细胞外基质的微环境，具有细胞之间的通讯、氧气和营养物质的转运、排出废物和细胞新陈代谢等功能，满足一定的孔隙率要求。Pan 等[4]对组织工程软骨与软骨下骨的最佳孔隙率进行了研究，指出组织工程软骨与软骨下骨支架材料的最佳孔隙率分别为 92% 与 77%。

由此可见，具有最佳效果的支架材料必然是仿生型材料。因此，在组织工程中需要引入这样的 3D 支架，模拟软骨细胞发育的微环境，将细胞有序地组织起来，以便达到预想的目的与效果。这些支架的功能是协助细胞的增殖与分化，帮助细胞顺利向外扩散营养素与表达产物，向细胞与细胞内传递特定的力学和生物信息。Zorzi 等[5]将脂肪间充质干细胞接种到支架上，移植到羊的股骨内侧股骨髁缺损上，结果显示，接种了间充质干细胞的支架组修复效果及评分要优于单纯支架组及空白对照组。

2 软骨组织工程支架材料的分类

根据组织工程支架材料的来源，软骨组织工程支架主要分为以下几类：

2.1 天然聚合物

天然材料因其来源是天然的，相对来说有很多优点，比如生物相容性好、容易降解、毒性相对低、易吸收、不易产生炎症反应等，但同时也有一定的不足，比如机械强度差、产品不易控制。天然材料主要包括藻酸盐、琼脂糖、胶原、明胶、纤维蛋白胶、天然脱细胞基质材料、脐带沃顿胶等。

藻酸盐是比较早用于支架制作的天然材料，藻酸盐支架可以为种子细胞生长提供适宜的环境，特别是，交联的藻酸盐水凝胶通过包封水凝胶和多孔结构里的细胞来维持软骨细胞及其球形细胞形态[6]。通过微环境模拟软骨的胚胎发育促进软骨形成和维持细胞表型。但是藻酸盐不容易被哺乳类动物代谢降解，而且，其机械性能差和极易降解限制了其应用。胶原和明胶也可以维持软骨的表型并产生基质，但机械性能差，在体内的作用不确定[7]。据报道，交联可以使胶原分子内部和分子间通过共价键结合以提高胶原纤维的机械强度和抗降解稳定性。交联方法包括物理交联法和化学交联法，其中以化学交联法为主。化学交联一般能达到较好的均一交联效果[8]，常用的化学交联剂包括碳化二亚胺、戊二醛、己异二氰酸酯、京尼平等，这些交联剂在赖氨酸、羟赖氨酸、精氨酸等残基之间通过单体或多聚物形式交联。目前针对应用于软骨组织工程的支架，也多采取化学交联的方法，EDC类交联剂可以在室温条件下使胶原发生交联，并且毒性较低，避免生物体出现严重的炎症反应。

脐带中的沃顿胶和软骨基质具有相似的组成成分和生物学功能，并且免疫原性低，具有抑制免疫排斥、诱导宿主免疫耐受的能力。吴鸿[9]以脐带沃顿胶制作新型生物软骨支架并体外初步构建组织工程软骨，结果显示以此制作的支架具有与软骨相似的组成成分、良好的微观结构以及理化性能，细胞黏附率高，细胞毒性低，具备生物安全性和良好的生物相容性。吕涵宁等[10]采用第 2 代软骨细胞与人脐带沃顿胶取向支架复合培养，证实人脐带沃顿胶取向支架具有良好的亲和性和细胞相容性，有利于软骨细胞黏附和增殖，细胞存活率高，是一种比较理想的软骨组织工程支架材料。

2.2 人工合成材料

与天然生物材料相比，人工合成材料具有良好的生物相容性和力学强度，降解速率可控制，塑形效果较好，可以通过调整聚合物的比例、相对分子质量满足不同的需求，但该类材料亲水性差，对细胞亲和力弱。常用于软骨组织工程支架的人工合成材料主要是各类可生物降解的聚合物，如聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、聚己酸内酯（PCL）和聚 L-丙交酯-ε-己内酯（PLCL）等。

PLA 是一种人工合成的高分子材料，具有良好的力学性能，安全性高，且可被组织代谢吸收，代谢产物乳酸不会对人体产生毒性。经聚乙二醇（PEG）表面修饰的 PLA 具有更好的亲水性和三维结构，降解速率明显加快[11]。Izal等[12]将骨髓 MSC 种植于左旋聚乳酸（PLLA）支架上，结果显示 PLLA 支架可有效吸附 MSC 并促进 MSC 向软骨分化和细胞外基质（ECM）沉积。

PLGA 已经作为支架材料广泛用于软骨组织工程。Zhang 等[13]采用动态压缩与外源性 SOX-9 结合对三维多孔 PLGA 支架上接种的脂肪间充质干细胞成软骨能力进行评估，结果表明动态压缩与外源 SOX-9 在 PLGA 支架上对脂肪干细胞诱导形成软骨有促进作用，有利于关节软骨再生。Kwak 等[14]将软骨细胞接种到经富血小板血浆预处理的PLGA 网状支架上修复裸鼠的半月板，荧光显微镜显示在接种后 24 h 软骨细胞在整个支架中附着均匀。电镜结果显示支架的空隙间相互贯通连接，修复半月板效果较好。Camarero-Espinosa 等[15]研究了多层聚合物纳米复合支架，这种支架可以模仿软骨的结构设计、化学信号和成熟的关节软骨的机械特性，以空间控制的方式引导培养的软骨细胞的形态、方向和表型，支持组织的生长，这种方法可以模拟天然软骨，促进局部羟基磷灰石的形成，并与软骨下骨整合。

2.3 混合支架

通过人工合成和天然聚合物的结合获得有效的支架从而使软骨再生，这方面也做了很多研究。经典的混合支架组织工程策略是基于随机细胞接种和生长因子管理。该框架内细胞的分布和生物活性调控是不均匀和不可控的。这些缺点导致在组织构建中血供不足和细胞不能正确地融合，甚至细胞死亡。有一种新的生物制造方法，称为“三维生物打印技术”，这种方法的引入可以克服上述缺点[16]。虽然这种技术是通过逐层打印的方式来构造物体，但是组织可以直接由细胞和细胞外基质蛋白以有序空间位置进行构建。多头沉积系统和立体印刷已被用来排列各种组件，包括人工合成和天然聚合物、蛋白质、具有特定空间序列的细胞等。生物印刷技术促进了组织工程支架的发展，它模仿了天然关节软骨的带状结构。Shim 等[17]最新研究报道称三维细胞打印PCL-藻酸盐支架是用多头沉积系统包封软骨细胞和生长因子。封装在藻酸盐水凝胶内的细胞的生存力不会被打印系统影响。植入 4 周后，在细胞打印的 PCL-藻酸盐支架内软骨显示了更高的细胞外基质和糖胺多糖含量并且没有任何免疫排斥反应。三维设计的混合型支架在动物模型中的应用发展仍需进一步探讨。

近些年在支架的制备方面，特别是材料方面有了很多新的技术与趋势。一些学者在研究中发现，结冷水凝胶、硫酸软骨素、壳聚糖与透明质酸在软骨组织工程中有良好的应用前景[18]。Alves da Silva 等[19]利用纤维粘合技术制出以壳聚糖为基础的纤维网状支架，应用于软骨组织工程的支架制备。Tang 等[20]的研究证明，自体骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质支架或可直接诱导软骨细胞分化而无需外源性生长因子。Sheykhhasan 等[21]使用脂肪来源的间充质干细胞，在有转化生长因子 β3 的条件下，比较了纤维蛋白胶支架、聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架和藻朊酸盐支架在相同环境下的差别，结果显示纤维蛋白胶支架组中细胞分布均匀且增殖与软骨方向分化最佳。Luo 等[22]将猪的关节软骨进行脱细胞处理后制成组织工程支架，并与人软骨祖细胞进行共培养，也取得了良好的效果。

3 软骨组织工程支架制作新方法

对于支架来说，能够重复组织本身的多层结构对于细胞的生长和组织的再生是很重要的。He 等[23]开发了熔融体3D 打印技术，制作了聚 ε-己内酯三维组织工程支架，复杂的曲面几何形状和微型纤维结构都可以呈现，并可以模仿原生组织的分层结构，为组织工程支架制备提供了一个新的方法。

天然的细胞外基质有一定的纤维属性，这使得很多研究者把研究重点放在了以纤维为基础的支架上，不同研究者应用的技术也不尽相同，有基于聚合物溶液的湿法、干-湿法与熔融纺丝法，纤维网状结构的支架也可以通过种类繁多的针织方法来加工，也可运用压力与温度相结合的物理性工艺。Shao 等[24]采用绿色水溶剂同轴静电纺丝法制备了一种由羟基磷灰石和柞蚕丝素蛋白组成的纳米结构的复合支架，该材料具有良好的仿生和力学功能，是一种优良的具有生物相容性的骨组织工程支架。Zheng 等[25]采用动态-水流接收系统制备静电纺丝取向型聚 L-乳酸-聚 ε-己内酯共聚物/I 型胶原纳米纤维纱作为冻干 I 型胶原/透明质酸的软骨相（海绵）骨架，这种支架同时含有结构和生物学标志，可以引导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。体外结果表明，纳米纱 I 型胶原/透明质酸混合支架在促进取向、黏附力和骨髓干细胞的增殖方面比海绵支架更优。此外，经证实，接种在纳米纱 I 型胶原/透明质酸混合支架上的骨髓基质细胞培养 21 d 后，II 型胶原蛋白表达和糖胺聚糖含量明显增加。

Barron 等[26]使用激光微加工技术和热卷边技术创建了一个功能性梯度网络支架，并通过兔模型来评估生物相容性，结果表明没有炎症或巨细胞产生。

细胞膜片的 3D 组装也已经被成功应用于软骨、血管、皮肤等组织，并已经有临床产品用于患者。Itokazu 等[27]从人类骨髓间充质干细胞创建稳定的无骨架的软骨样细胞片，并评估其移植到裸鼠大鼠骨软骨缺陷后的影响，结果显示用此细胞膜片的软骨修复情况比对照组好，且 12 周 Wakitani评分显著改善。

微组织作为基本结构单元，也被成功用于组织的再生。Yin 等[28]对软骨片进行湿法粉碎、过滤和脱细胞处理，成功制备了以软骨细胞外基质源性微粒（CEDPs）为基础复合软骨细胞或 MSC 构建的微组织，修复大鼠、兔膝关节软骨缺损，修复效果很好。这种微组织的方法用于软骨修复为软骨组织工程开辟了新的方向，并可能进一步广泛应用于临床手术。

4 软骨组织工程支架的微观结构控制

很多组织的基膜存在着大量会影响细胞行为（包括黏附、增殖、迁徙与分化）的纳米级结构[29]，骨细胞外基质的成分比如胶原与磷酸盐都富含纳米结构，都有可能在细胞基质信号传导中起作用。天然细胞外基质的纳米结构具有很多特别的理化性质，这对于其包绕细胞的生物信号有着重要且微妙的影响。有研究人员制成了比以往更接近天然细胞外基质的纳米结构支架，这种工程化纳米材料至少在一个维度上小于 100 nm，可以在一定程度上模拟细胞外基质与修复受损组织[30]。为了能够达到有效支持干细胞的目的，在过去的十年中不断有纳米纤维、纳米管、纳米颗粒制成的支架出现。这其中关于纳米纤维的报道为最多，应用的材料从合成可降解的高分子聚合物如聚乳酸、聚乳酸-羟乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚己酸内酯[31-32]，到天然材料如胶原、明胶与壳聚糖[33-35]；在骨移植手术中需要力学性能强大的材料，故有学者研究的纳米管如碳纳米管、二氧化钛纳米管也为组织工程支架提供了另外的选择。Levingstone 等[36]对多层的软骨支架进行了研究，证明了无论对于软骨细胞进入支架后的横向扩散与分层，还是对于软骨下骨的修复及潮线的形成都比一般支架更好。

传统方法制备软骨支架有几个关键条件无法精确控制：支架的尺寸，孔隙的形状，孔隙之间的联系以及分布。快速成型技术的进步使得支架的形态与最终形态可控程度大大提升，对于所产生孔隙相对于细胞偏大的问题，可以利用其与静电纺丝和纳米纤维技术的结合或依靠支架孔隙渐变技术来克服[37]，而 3D 测绘技术可以确保组织工程支架在力学上的稳定[38]。生物 3D 打印技术的发展也很快，可使用聚合物与水凝胶混合打印制成支架[39-40]。He 等[41]通过 3D微控水凝胶平台成功地使鼠诱导多能干细胞衍生为软骨，使自体组织工程软骨移植物有可能实现，不需要依赖于有限的和侵入性的自体软骨细胞采集。Jia 等[42]使用热致相分离技术（thermal-induced phase separation，TIPS）制备了一种细胞外基质来源的定向支架，采用非定向支架作为对照组，与骨髓间充质干细胞复合修复兔关节软骨缺损，在术后 24 周，虽然组织学和免疫组织化学分析与对照组没有明显不同，但是定向支架杨氏模量高出对照组 3 倍，生物力学特性更接近正常软骨。

5 总结与展望

关节软骨损伤是骨科常见的疾病，目前，常用的方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植等技术都有各自的局限性，组织工程技术的出现为关节损伤的治疗带来了新的希望。通过组织工程的方法来修复受损组织需要跨学科的综合研究，要求结合仿生学、细胞生物学、材料学等不同领域的最前沿发展，随着科学的发展，软骨组织工程支架材料的研究与应用在体内实验及体外实验均已取得长足的进步，但离理想的软骨支架材料还有很大的差距，目前应用的材料均存在着这样或那样的缺陷，比如形成的软骨仍为纤维软骨，而非透明软骨；修复后的软骨力学性能还不尽如人意；支架降解速度与软骨的形成速度不十分一致。但随着新材料的开发，制备技术的改良，会出现更符合人体关节软骨天然结构及功能的支架材料，实验成果将会更好地向临床转化，甚至于市场化，更好地服务人类，为软骨损伤患者带来新的希望。

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271000 泰安，泰山医学院运动医学研究所（吴琪），医学与康复学院（亓建洪）

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com

2016-11-21

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.016