2015年以来甜叶菊微繁殖研究与应用的发展

唐玉花，马龙彪

2015年以来甜叶菊微繁殖研究与应用的发展

唐玉花1，马龙彪2，3*

（1.甘肃省武威市凉州区发放镇人民政府农业技术推广站，武威733000；2.黑龙江大学农作物研究院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080）

对2015年以来刊登的甜叶菊微繁殖/离体繁殖/组织培养方面研究的文献进行综述，为甜叶菊遗传保真性、快速繁殖及商用大规模繁殖提供信息与参考。

甜叶菊；微繁殖/离体繁殖；组织培养；发展

甜叶菊是自交不亲和、虫媒传粉的短日照植物。甜叶菊是由种子进行商业化规模的栽培种植，但传统培养是困难的。由于种子生命力弱、发芽率低是限制大规模栽培的因素之一。营养繁殖也受其单株的个体数量低的限制，低效无性繁殖法不符合目前商用栽培繁殖需求。因此，体外繁殖是一个很有前途的替代方案来解决这个问题，因此组织培养、微繁殖是甜叶菊大规模快速繁殖的唯一选择，甜叶菊芽尖或腋芽培养的微繁殖可获得遗传稳定、真正纯种的后代。然而，目前微繁殖芽数低且生产成本高。因此各学者开展了提高甜叶菊繁殖系数、降低生产成本的研究。

1 不同基质对甜叶菊愈伤组织的诱导、芽增殖及生根的影响

1.12,4-D、IBA、NAA、IAA、BAP、GA3、KIN、2iP

MZ Karim等进行了甜叶菊叶组培生产甜菊糖苷（St）试验。叶片诱导愈伤组织，在MS+2.0 mg/L 2,4-D培养基中愈伤组织最好，呈脆弱、绿色；在MS+6.0 mg/L 2,4-D培养基中的愈伤组织最低。甜叶菊叶片诱导愈伤组织IBA表现效果较好，但NAA效果差。叶外植体可作为愈伤组织生产的最佳材料。1.0 mg/L BAP愈伤组织形成芽效果较好，观察到健康的和最高的芽数；8.0 mg/L BAP成芽最低。最佳的芽生根诱导是在MS+2.0 mg/ L IBA培养基中，NAA有效，但IAA效果最差。经过炼苗，在田间95%的植株存活，所有的植株都是健康的、无病的、状况非常好。用此方法，大量的甜菊植物一年四季均可生产，可用于St商用生产。田间收获的成熟叶经HPLC分析，样品中St的含量是9.6%[1]。

B Yücesan等在体外研究中，均采用种子萌发产生的母株进行腋芽再生。节点外植体置于再生培养基，改良的MS培养基（含有0.1～0.5mg/L不同浓度的IAA）。再生芽生根成功后，转移到温室炼苗。在60d内有可能从一个单一的节点获得16个小苗（10cm）。直接萌发或腋芽再生的所有苗转移到大田（试管外），4个月后收获。与常规苗相比，体外培养的甜叶菊平均芽较长（54.5：44.4）。采用RP-HPLC测定甜菊糖（SGs）含量，在体外植株共有16%的SGs，其中11.7%是莱鲍迪苷A（Reb A）[2]。B Yücesan等又研究了甜叶菊MS基本培养基有效的微繁殖方案，以期开发为商业使用。节段培养再生芽，培养3周后所有的处理每个外植体都产生两个芽，不过高浓度KIN和BAP（1.0或2.0mg/L）诱导的愈伤组织更多。在MS+0.25mg/L IAA培养基完成了生根培养，培养3周后每个芽产生8.1个根。再生苗在便携式温室炼苗3周，再生植株和种子幼苗转移到大田16周，其植株叶SGs含量没有差异。Reb A含量为4.7%～5.0%（w/w），而St含量为6.4%～6.9%（w/w）。营养生长后期和开花期无差异。此研究成本效益好，可实现甜叶菊大田体外高效大规模生产栽培[3]。B Yücesan等在另一项研究中，再生芽形成6周，随机选择体外发芽幼苗的节点在MS培养基上培养（添加或不添加0.1～2.0mg/L 6-BAP或KIN）。结果，所有的处理对芽诱导是有效的，培养3周后每个外植体平均产生两个芽，随后间隔3周接种到MS培养基中，所有节点的再生芽转移到MS培养基（添加或不添加0.25或0.50mg/L IAA、IBA、NAA）培养3周进行生根。IAA对生根更有效，每个芽生7.6个根，生根率为100%。所有的再生根（根长13.5cm）株盆栽并在温室炼苗2周，然后转移到大田14周存活率高＞99%。同样，来自种子发芽8龄的盆栽幼苗也转移到同一大田。再生苗和种子苗在营养后期和开花期的形态、产量和SGs成分没有显著差异。表明使用节点外植体的无性繁殖对于高优质芽的生产（Reb A含量11.7%w/w）是有效的[4]。

M Tomaszewska-Sowa等的研究，用无菌单节茎段在激素合成基质中培养得到了很多的芽，再经过伸长和生根的过程。含0.5mg/dm3BAP的培养条件芽增殖率最高，而在0.5mg/dm3GA3培养条件茎的长度、芽的叶片数和叶片大小最好；在0.5mg/dm3IBA基质中生根过程得到强化，此种激素生根数最大，且根最长。制备的微体苗置温室中炼苗，炼苗阶段是在灌注25%盐溶液MS中进行的，与蒸馏水比，产量增加了46%～70%[5]。

A Yadav等采用RAPD标记监测甜叶菊体细胞无性系变异。在MS+BAP 2.0mg/L（EM4）培养基中，节点外植体在4.7±0.20d最大芽诱导98%±2%；茎尖外植体7.1±0.34d诱导74%±2.45%。再生芽在MS+0.3 mg/L BAP+0.3 mg/L KIN+0.1 mg/L NAA+15 mg/L PEG培养基上培养30d，最高可产生40.5±0.26个芽；在1/2 MS+ 0.5 mg/L NAA培养基中7.4±0.26d可生根/生芽21.2±0.3个。生根芽被单独分离，在温室硬化。使用RAPD引物对甜叶菊硬化植株进行遗传稳定性筛选。共有24个RAPD引物共产生82条明显的可得条带，每对引物平均3.4条带，扩增产物平均100～1100 bp；RAPD引物条带数1～7。微繁殖植株RAPD图谱是单态的与母株类似，证实其遗传是稳定的[6]。

A Yadav等又为开发有效的和可重复的可再生的大规模增殖方案进行了试验。茎尖和节段作为外植体。当外植体用0.1%HgCl2处理3min，0.2%多菌灵和0.2%链霉素处理45min，节外植体生存率是100%。节点和茎尖外植体效果最好的培养基是MS+2.0 mg/L BAP，节点和茎尖外植体表现最大的不定芽诱导率，分别为4.7d 98.0%、7.1d 74.0%。单独使用BAP对甜叶菊无菌培养是更好的，可替代细胞分裂素和生长素的不同组合；节点和茎尖外植体再生芽，MS+0.3 mg/L BAP+0.3mg/L KIN+0.1 mg/L NAA培养基是最好的，培养30d可得34.9个芽/外植体；生根，1/2MS+0.5mg/L NAA生根效果最好，7.4d每个芽可生根21.2个，最大生根率90% ±7.75%。在没有激素的培养基中生根不健康。生根的单个芽体转移到塑料袋（沙子、土壤和蚯蚓堆肥的比例为1∶1∶1），存活率达100%。硬化的植株被转移到大田中[7]。

J Madhavan提出了甜叶菊节点外植体体外增殖改良的方案。研究了实验室级尿素梯度对节段外植体多芽诱导的影响。最初节点外植体在MS基本培养基上培养2周以促进腋芽突破基。进一步，在MS+BAP 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L（添加和不添加尿素5.0 mg/L）培养基培养40d，结果，添加尿素的单个节段外植体生产最多的芽44.56个，不添加尿素的为22.44个。产生的芽数量差异显著，这些芽在MS+NAA 4.0 mg/L培养基容易生根。在这些植株中主要和次要硬化是成功的。在微繁殖苗中没有明显的形态异常苗。遗传分析显示这些植株遗传是一致的。本方案的优点是多芽诱导、生根和硬化的全过程在6个月内完成[8]。

M Kumari等通过甜叶菊直接和间接器官的叶和节点外植体离体繁殖方案来开发生产高价值的次生代谢产物，进行体内抑菌试验和体外植株提取试验。植物生长调节剂的组合证明，叶外植体好于单一愈伤组织和直接芽增殖。KIN 1.5mg/L+IAA 1.5mg/L处理均获得最佳的愈伤结果（85.5%±0.33%）。KIN 2.5mg/L+IAA 1.5mg/L处理的愈伤组织的芽增殖数量最大（5.3±0.3），芽最长9.03±0.14 cm；KIN 1.5mg/L+BAP 2.5mg/L处理叶外植体的增殖芽数最多（8.6±0.33），芽最长5±0.11cm。愈伤组织的体外再生芽次生代谢产物（St：0.451± 0.001mg/g；Reb A：0.131±0.005 mg/g）较高。也证明了较好的抗菌活性，所测试细菌最大抑菌区：B.subtilis（13.6±0.3 mm）、S.aureus（12.3±0.33 mm）、P.fluorescence（8.6±0.3 mm）及E.coli（10.3±0.1 mm）[9]。

EJ Naranjo研究评估了植物生长调节剂的不同组合（2,4-D、IAA、IBA、2iP和玉米素）对体细胞胚发育和诱导的影响。腺嘌呤和椰子水也添加到含有混合盐和谷氨酰胺的基本培养基（MS）。2,4-D 18.09μM和N6-异戊烯基腺嘌呤（2iP）7.38μM的组合每个外植体产生细胞胚的数量最多，具有明确的特征。基因型表现出显著的胚性反应效应。在“SRQ-93”基因型，实现了体细胞胚的形成和发展，而基因型“Bertoni”和“Morita II”只分别产生胚性和非胚性愈伤组织。在含GA3（0.29μM）和活性炭的再生培养基获得了转化苗[10]。

NRA Rashid以茎尖和节段作为外植体诱导再生芽，茎尖在MS+1.0mg/L KIN培养基培养3周，表现出最高的芽增殖。2周后MS基础培养基芽伸长和生根被成功地优化了。培养3周后随着IBA浓度的增加根的诱导逐渐下降。相比之下，0.25 mg/L IBA促进根的形成效果最好，诱导的根很短而硬且多毛。在临时浸没式生物反应器系统进行甜叶菊芽大量繁殖，表现出快速与连续生产体外甜菊苗很大的潜力[11]。MA Ramírez-Mosqueda等用自动临时浸泡的接受者建立商用甜叶菊微繁殖方案，达到低成本和自动化的方式实现大量繁殖过程。结果显示，每个外植体每8h在20mL的1.0mg/L BA中浸泡2min，最高芽数为18.37。在没有植物生长调节剂（PGR）的MS培养基上获得100%的生根芽，90%的再生植株在温室条件下成功地炼苗。再生植株表现出较低的遗传变异率（10.4%）。本方案可应用在甜叶菊商业微繁殖[12]。

1.2聚乙二醇（PEG）、脯氨酸、甲醇

Gupta P等进行了甜叶菊经脯氨酸和PEG处理其愈伤组织和悬浮培养增加SGs产量的试验。从甜叶菊叶片获得黄绿色紧凑的愈伤组织，在MS培养基上添加2.0mg/L NAA和2.5～10mM脯氨酸与2.5%～10% PEG，在24±1℃和22.4μmol/（m2·s）的光强度（白色荧光管16 h）进行继代培养2周。在5.0mM脯氨酸和5% PEG的浓度，愈伤组织和悬浮培养生物量增加了，继续增加浓度，它们却降低了。在用诱导因素处理/不处理两种情况下对愈伤组织（第15天收集）和悬浮培养（第10和15天收集）的SGs含量进一步做HPLC分析，SGs的生产显著增强了。在愈伤组织，在添加7.5mM脯氨酸和5%PEG时，SGs含量分别从0.27%（对照）增加到1.09%和1.83%，约是对照的4.0和7.0倍。然而，在悬浮培养的情况下，相同的脯氨酸和PEG浓度使SGs含量在第10天分别从1.36（对照）增加到5.03%和6.38%，是对照的3.7倍和4.7倍[13]。M El-Zaid进行了7个甜叶菊基因型的形态学和细胞学特征及过氧化物酶同工酶的生化遗传变异研究。组织培养技术利用不同浓度的植物激素产生更多的芽来确定各基因型的愈伤组织诱导和再生的最佳培养基，测定了干旱胁迫下不同浓度的PEG对所有基因型的可培养愈伤组织效果等[14]。

MJ álvarez-Robles等为商业利益找到增加次生代谢产物生产的方法，用不同浓度的甲醇进行了甜叶菊体外芽培养。从植株提取物分析可知添加1.5%（v/v）甲醇培养基导致最高的抗氧化能力，甜叶菊芽总可溶性酚、黄酮类化合物、羟基肉桂酸化合物与抗氧化能力之间关系密切，也同样提高。在0.1%（v/v）甲醇培养芽再生SGs达到最高的水平，约为对照的2倍多。结果表明甲醇代谢途径的差动敏感度导致甜叶菊叶的SGs和酚类物质的积累。甲醇为生物活性化合物生产开辟了宝贵的新途径[15]。

1.3纤维素酶、离析酶、崩溃酶、果胶酶、玉米素、蔗糖、甘露醇

M Lopez-Arellano等为建立高效可繁殖的甜叶菊原生质体再生方案，研究了酶的类型和浓度、渗透压、培养时间、植物材料类型和年龄等因素。使用酶混合物：2%纤维素酶+1.5%（w/v）离析酶+0.2%（w/v）崩溃酶+ 0.1%（w/v）果胶酶在0.5甘露醇+2.5mM CaCl2.2H2O和5mM MES在pH值5.8培养基中从体外生长的4周龄植株叶成功地分离出原生质体。在酶液中4h黑暗培养获得了约（8.4±0.40）×106g鲜重存活率98.8%±1.39%的原生质体。活的原生质体通过16%蔗糖溶液离心收集，经琼脂糖珠或浅层液体培养技术，每5×105mL密度的原生质体在KM8P培养基中添加0.2 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L玉米素+0.15M蔗糖+0.3M甘露醇培养。原生质体在24h内细胞壁再生，培养后2～3d开始第一细胞分裂，4周内观察到小菌落的形成。逐渐加入较低渗透压的新鲜培养基，有利于细胞分裂。与液体培养相比，琼脂糖珠培养提高分裂频率近1.5倍，且再生植板率分别为13%和9.1%，成活率分别为23.5%、14.8%。转移到MS+1.0mg/L BA，单独或与NAA或与2，4-D 0.1 mg/L组合培养基，经8周的胚胎发育，愈伤组织的原生质体产生完整的植株。再生植株在土壤中存活，形态和生长性状均正常。该方案可能利用原生质体的再生体系通过体细胞杂交、体细胞无性系变异和遗传工程对甜叶菊进行改良[16]。

1.4ALG、CH、PEC、YE、MeJA、SA、CHI、杏胶

M Bayraktar等进行了甜叶菊微繁殖不抑制植物生长、可提高植株次生代谢产物含量的研究，甜叶菊节点外植体在木本植物培养基（WPM）[海藻酸（ALG）、水解酪蛋白（CH）、果胶（PEC）、酵母提取物（YE）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）或壳聚糖（CHI）]上培养。观察了含有不同成分WPM培养基再生芽情况：含有1.0 g/L YE（最高芽数）；100μM CHI（芽长、节数、叶数）；0.5 g/L CH（叶长）和1.0 g/L ALG（茎粗）。在WPM（0.5、1.0或2.0 g/L PEC，1.0 g/L YE，或50μM CHI及对照）根系再生频率达到100%；WPM含有0.5 g/L PEC的根数最多，WPM含有1.0 g/L YE的根长最长；100μM CHI处理的生物量积累最高。据HPLC测定结果，除200μM CHI，100或200μM MeJA和200μM SA处理，剩余的诱导处理均比对照提高了St的生产。0.5 g/L ALG和2.0 g/L YE处理的体外苗St产量分别从1.56 mg/g干重增加到14.69和14.54 mg/g；仅在0.5 g/L ALG处理观察到Reb A为0.55mg/g干重。田间生长植株的St含量为15.06 mg/g干重[17]。

植物组织培养的生长和形态可通过少量的一些有机元素而改善，除了天然来源的碳，有机添加剂可能含有天然维生素、酚类、纤维、激素和蛋白质。S Khorsha等测定了添加2.0～6.0 g/L杏胶对胡萝卜、甜叶菊和葡萄3种植物的再生能力和生长速率的影响。结果杏胶大大减少了甜叶菊生根时间，微扦插苗接种在杏胶6.0 g/L的培养基在不到一周的时间完成生根（只有6.5d），而对照植株完成生根至少10d。在杏胶的培养基根的长度也增加，但是，不同处理根的数量并没有显著差异。添加杏胶的培养基试管苗长度和叶减少了，而叶面积和侧枝增强了。看来较低浓度的杏胶（2.0和4.0 g/L）导致更好的营养生长。对叶色素沉着也有类似的趋势，因此，2.0g/L杏胶对叶色素沉着和暗绿色的生产更有效。在商用组织培养方案高度推荐使用胶，但需进一步开发研究植物衍生胶作为植物组织培养基质替代碳资源[18]。

1.5琼脂、TDZ、KH2PO4、MgSO4、活性炭

H Lata等通过评价酚类化合物和自由基清除及与母株对比，来研究体外再生方案的可靠性。含有腋芽的节段进行体外繁殖，外植体接种于MS+3.0%（w/v）蔗糖+0.8%（w/v）琼脂+1.008M TDZ（噻苯隆）培养基诱导芽，然后进一步转移到无任何调节剂的1/2MS培养基生根。在土壤中成功建立了全根试管苗，在气候控制室内生长条件下，长至成熟成活率达95%。母株和组织培养的植株叶片样品在营养高峰期（开花前）收获。结果表明，体外繁殖株（IVPP）与母株（MP）相比堪称完美。测定平均酚，IVPP：107.70±3.95mg GAE/g干重（GAE，没食子酸当量），MP：108.18±1.59mg GAE/g干重；黄酮类化合物，IVPP：50.80±2.81mg QE/g干重（QE，槲皮素当量），MP：53.36±0.46mg QE/g干重）和DPPH与细胞抗氧化（CAA）性能。这些结果，确定组织培养无性系的保真度可繁育甜叶菊植株[19]。

AR Modi等介绍了甜叶菊高效微繁殖方案。在体外芽增殖不同的培养试验中，无激素液体培养基最适合。当单节外植体在改良MS+1.0%蔗糖+0.7%琼脂培养基中继代培养4周后，每个芽的最高节点数是5.4个，芽长是4.76cm。在1/2MS大量元素+MS微量元素+170 mg/L KH2PO4+185mg/L MgSO4塑料生长容器中最高增殖率为9.56%。RAPD标记分析体外培养的植株保真度良好，没有显示任何体细胞无性系变异[20]。

A Mehrafarin等研究了MS和1/2MS培养基加IBA、NAA和活性炭对根诱导的影响。增殖结果，生长调节剂水平无显著差异。生根数据表明，对叶长、地上部干重、根鲜重，生长调节剂之间差异显著。生长在无炭基质的试管苗生物量高于添加2.0mg活性炭的基质，在1/2MS+0.2mg/L IBA+2.0 mg/L活性炭培养基中生物量最高（8.18%）。表明植物生长调节剂可影响芽的增殖和生根。甜叶菊的微繁殖可提高改变大量元素浓度，增加活性碳。总之，1/2MS+0.2 mg/L IBA+2.0 mg/L活性炭对St含量最优[21]。

1.6纳米粒子ZnO

IV Alvarado-Orea等评价了SGs在甜叶菊根积累情况。培养20d后最大生物量和St产量分别为10.24mg/L和4.0mg/g，在5×10-6（T1）和15×10-6（T2）浓度的纳米氧化锌（NPs ZnO）下增加了，St和Reb A分别是对照（St 2.7mg/g、Reb A 6.1 mg/g）的1.5、4.7倍和4.7、6.4倍[22]。R Javed等研究了不同浓度（0、0.1、1.0、10、100或1000mg/L）的氧化锌（ZnO）纳米粒子（34nm大小）对组织培养中生长的甜叶菊芽的生长参数、Reb A与St和抗氧化活性的影响。在1.0mg/L ZnO纳米粒子的浓度形成的芽比例最高（89.6%），表明该浓度ZnO纳米粒子处理比其它处理或无ZnO纳米粒子的处理有良好的影响。此外，HPLC结果说明在1.0 mg/L纳米ZnO的氧化胁迫下微繁殖芽的SGs显著增强（几乎是对照的2倍）。这一发现进一步肯定了随着氧化压力的提升和活性氧（ROS）的产生，DPPH清除活性、总抗氧化能力、总还原力、总黄酮和总酚含量在提高。然而，当超过1.0 mg/L浓度的ZnO纳米粒子阈值和低于1000 mg/L后，抗ZnO性、次生代谢产物的形成和生理参数出现突然下降。这是评价ZnO纳米粒子用于甜叶菊有利的和不利影响的第一项研究[23]。

1.7Eriksson（ER）基质、White基质、Gamborg（B5）基质、Nitsch基质

J Mehta的不同培养基研究结果，甜叶菊茎尖、节段作为外植体，在不同的基质，如Eriksson（ER）基质、White基质、Gamborg（B5）基质、Nitsch基质，添加不同浓度的BAP。这些基质中，ER+3.0 mg/L BAP培养基获得最好的结果，在White+1.0mg/L BAP培养基得到令人满意的结果，在B5+3.0mg/L BAP培养基增殖质量好，Nitsch+2.0 mg/L BAP培养基增殖质量较好[24]。

1.8光照的影响

荧光灯是各种植物的离体培养最常用的光源。然而，还有其他的光源，如发光二极管（LED），已被证明是体外培养更有效的。MA Ramírez-Mosqueda等评估了LED对体外形态发生、芽增殖、生长和生根的影响。为此，测试了5种不同来源的16 h光周期：荧光灯（Fl）、白色LED（W）、红色LED（R）、蓝色LED（B）和蓝红LED组合（B/R，1：1）。与Fl光相比，R LED增殖率较高，虽然其芽的长度较低；在B/R LED的芽最长。在生根过程中，LED并没有提高芽的生根，但提高了光合色素含量，从而促进了试管苗的炼苗进程[25]。B Yücesan等试验结果2000～3000lx光照的种子发芽率较高，2d内达到50%的芽率，几乎所有的种子在1周内发芽。幼苗在温室条件下（25℃，配备侧白冷荧光灯，3000klx）进一步生长发育12周，再进行后续试验[2]。TFO Silva等比较了在体外和在体内生长的甜叶菊形态解剖横切面根，体外系统是在黑暗和光照条件及滚瓶系统旋转摇动培养基用来维持根的生长，比较了甜叶菊的根生长在体外的横截面结构和形态差异（与对照比）；在培养基中维持的根，其发育受基质透气、糖浓度和光照程度的影响。GC-MS和TLC证实了甜叶菊体外生长的根具有产生代谢产物的能力，与野生植株产生的代谢产物类似[26]。

2 农杆菌诱导毛状根

植物次生代谢产物绿原酸及其衍生物（CADs）是对健康有益的生物活性物质。为了提高其产量，以发根农杆菌C58C1和甜叶菊无菌叶片为材料，选取生长迅速的毛状根，接种于1/2MS液体培养基进行摇瓶培养，建立了毛状根液体培养技术体系。并优化了生产CADs的培养条件。进一步的基因检测结果表明，发根农杆菌Ri质粒上的rolB和rolC基因已成功地转导至甜叶菊基因组中，毛状根为农杆菌侵染甜叶菊叶片所致。分析表明，（3-咖啡酰奎宁酸（3-CQA），3，5-二咖啡酰奎宁酸（3，5-CQA）和4，5-二咖啡酰奎宁酸（4，5-CQA）是毛根中主要的CADs。选择8个快速生长的单根，其中，T3的CADs收益率最高；添加40 g/L蔗糖的B5培养基比其他培养基更适于生产CADs，毛状根收获的湿重和干重分别为17.93和2.34 mg/100mL，3-CQA、3,5-CQA和4,5-CQA含量分别为39.44、57.72和2.48 mg/g，总绿原酸类化合物的产量高达233.54 mg/100mL，比未优化条件前的总产量提高了66.39%；在最佳培养条件下，这3个化合物的总含量达到105.58mg/g，总收率为234.40mg/100mL。通过甜叶菊毛状根培养生产绿原酸类化合物具有很好的应用前景[27-28]。

L Calderón-Gabriel等为了提高SGs的生产，通过农杆菌转化建立毛状根培养基，评价了3个农杆菌菌株LB9402、K599和AR4对甜叶菊毛状根的诱导影响。转化过程是由农杆菌介导的两种材料：下胚轴外植体和全苗。感染后1周开始出现毛状根。这些根从外植体分离和独立培养在1/2MS培养基进行繁殖。LB9402菌株对甜叶菊表现出最大的诱导力，与其他菌株比7d和15d后大量毛状根被诱导[29]。Z Michalecwarzecha等也进行了类似研究，用甜叶菊植株的叶和节间在不同的生长条件下进行两株农杆菌ATCC 15384和LBA 9402转化。观察到毛状根的形成，外植体转化率取决于外植体的类型、接种时间和接种浓度。接种菌株LBA9402的试管内和试管外的离体外植体比接种菌株ATCC15384的转化率高。在光照条件下，毛状根的生长明显下降[30]。H Pandey等研究了农杆菌介导甜叶菊毛状根培养，探索关于低热量的二萜苷St尚未发现的生物合成潜力。在光照和黑暗条件下研究了4个稳定的毛状根体细胞无性系的生长情况，结果在黑暗表现出更好的生长。在光照下，其中两个毛状根体细胞无性系显示较高的光合色素积累。显然，在光照下，SRA4毛状根体细胞无性系有独特的St合成力，其它的无性系没有。RT-PCR定量分析表明UGT85C2基因与毛状根的光合作用能力相结合在调节甜叶菊的生物合成途径中起决定性作用[31]。

Madhumita Kumari等研究了甜叶菊叶片和茎段外植体的农杆菌介导毛状根的次生代谢产物生产。毛状根生长在MS基质（温度25°C，16 h光照）得到最佳的St生产。不同强度的MS和B5的基质中，全MS培养基生产的St为0.412±0.008mg/g，Reb A为0.100±0.008mg/g；在B5基质中毛状根生产的St为0.383±0.002 mg/g，Reb A为0.098±0.005 mg/g。毛状根在25℃±2℃下生长最大，随着温度的升高，毛状根生长下降。温度增加对次生代谢产物的生产没有太大的影响，St含量分别为：25℃0.425±0.08 mg/g，28℃0.415±0.08 mg/g，31℃0.386±0.02 mg/g，当温度增加到35℃，St含量迅速下降（0.090±0.02 mg/g），Reb A完全检测不到[32]。

3 结束语

我国作为世界第一甜叶菊种植大国、世界第一甜菊糖生产大国、世界第一甜叶菊出口大国。但是，我国甜叶菊产业大而不强，存在问题不少，亟待整体提升[33]。关于甜叶菊微繁殖/组织培养的研究全球正在如火如荼地进行。但是在查找到的2015年以来的约40篇文献中，仅有1篇属中文的，也仅有两篇属中国人的研究，我们这方面的研究远远不及国外同行，是过时了还是没得研究了？

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The Development and Application of Stevia Micropropagation since 2015

TANG Yu-hua1,MA Long-biao2,3*
(1.Agricutural Technology Service Station of Fafang Town People's Government,Liangzhou District,Wuwei,Gansu 733000;2.Crop Academy of Heilongjiang University/Sugar Beet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080; 3.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080)

The literatures published since 2015 about micropropagation/tissue culture research of stevia were reviewed and summarized,so as to provide information and references for genetic fidelity,rapid propagation,and commercial large-scale propagation in stevia.

stevia;micropropagation;tissue culture;development

S566.9；Q81

：B

：1007－2624（2017）03－0063－06

10.13570/j.cnki.scc.2017.03.023

2017-02-19

唐玉花（1979-），女，甘肃武威人，助理农艺师，从事农业技术推广工作。

马龙彪（1965-），男，黑龙江哈尔滨人，副研究员，硕士，主要从事甜菜生物技术的研究。E-mail：caasmlb@163.com，通信地址黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路号黑龙江大学农作物研究院