循环肿瘤细胞在肺癌中的应用

毕向雁 刘苓霜 姜怡 沈丽萍

循环肿瘤细胞在肺癌中的应用

毕向雁 刘苓霜 姜怡 沈丽萍

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指从实体瘤或转移灶脱落后释放进入外周血中的肿瘤细胞，CTCs检测与肺癌早期诊断、临床分期、预后评估有着密切的关系，对延长肺癌患者生存有重要作用。本文就CTCs检测技术以及其在肺癌中的应用进行综述。

肺癌循环肿瘤细胞分期疗效评价

美国癌症协会最新数据显示2017年肺癌死亡率在恶性肿瘤中居首位，即使接受了根治性手术的早期肺癌患者，也有45%在8～18个月内会出现复发或转移[1]，晚期肺癌患者5年生存率仅为4%[2]，转移是恶性肿瘤一大生物学特征。血中循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的出现是发生远处转移的前提[3]，是形成转移灶的关键环节[4]，因此检测外周血中CTCs对肺癌早期诊断、临床分期、疗效评价、基因检测具有重要意义。由于CTCs的检测较常规诊断手段如组织活检、放射检查等损伤小，更为敏感[5]，近年来对其检测及临床应用价值的探索成为研究热点。本文就CTCs检测技术以及其在肺癌中的应用进行综述。

1 CTCs概述

Ashworth在1869年通过显微镜观察到肿瘤患者血液中存在CTCs[6]。基于Ashworth的研究，1889年英国病理学家Paget提出了肿瘤学界著名的种子和土壤假说，成功地阐释了癌症复发和转移的机制。目前CTCs定义为由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的浸润和转移，部分肿瘤细胞出现上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），使肿瘤细胞的运动能力增强，极易侵入结缔组织间隙而进入血液循环系统，或者随着肿瘤扩张生长，毛细血管破裂，直接进入血液系统，形成CTCs[7]。进入血液循环的CTCs存在异质性，会受到自身免疫系统的排斥，最终仅有不足0.01%的CTCs能够存活[8]。这些逃过免疫反应的CTCs再通过间充质-上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）重新获得上皮表型，突破血管屏障，从而形成转移灶。因此，若在患者外周血检测出CTCs便可以作为肺癌诊断及发生转移的证据。

2 CTCs的富集方法

富集方法分为非特异性富集方法和特异性富集方法，常用的非特异性富集方法有：（1）密度梯度离心法，该方法操作简便，但价格昂贵，血液需要量大，灵敏度低，重复性较差，且CTCs可能迁入红细胞层造成丢失现象。（2）膜过滤法，此方法简单、经济，缺点在于一些较大的单核细胞容易与肿瘤细胞混在一起，而一些较小的CTCs也容易被滤过而造成丢失，因此缺乏较高的敏感度及特异度。常见的特异性富集方法为免疫磁珠富集法，阳性富集技术适用于抗上皮细胞黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）或抗细胞角蛋白（cytokeratin，CK）阳性的CTCs，阴性富集技术优势在于可以检出Ep－CAM或CK阴性的CTCs，能够避免肿瘤细胞发生EMT而导致CTCs阳性率的降低,也可将两种模式结合，既可保证靶细胞形态和功能的完整，又可提高富集效率，以便下一步检测。

3 CTCs的检测方法

CTCs的检测方法主要有：（1）免疫细胞化学法（ICC），该方法可以进行细胞大小和形态学的分析，但灵敏度低，难以满足临床诊断的需要。（2）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），该技术灵敏度高，但易受外界环境的影响，出现假阳性。同时，由于破坏了细胞结构，无法对CTCs进行后续计数及细胞形态方面进行分析。（3）酶联免疫斑点法（ELISPOT），这种方法只能识别活细胞，因为只有活细胞才能够分泌足够的蛋白。（4）配体靶向PCR法（LT-PCR），该方法是目前最新的国内原创CTCs检测技术，其原理是肺癌等CTCs表面会过量表达某些特异性受体，如叶酸受体（FR），通过细胞表面特异性受体与其配体类似物的结合来实现探针与CTCs细胞的结合，并且通过对探针的PCR定量检测来计算CTCs的数目。FR的表达具有很强的组织和肿瘤特异性，因此，配体介导的靶向PCR法，具有高度灵敏度，从而使CTCs能够探测早期肺癌。

4 CTCs在肺癌中的临床应用

4.1 辅助诊断目前肺癌诊断主要依赖影像学或病理学检查结果，对于反映肿瘤细胞微转移有一定难度，随着CTCs在肺癌诊断中应用价值研究的开展，越来越多的学者认为外周血CTCs检测可作为一种非侵入性的“液体病理”[9－13]。

Ilie等[14]检测无临床肿瘤证据的慢性阻塞性肺病（COPD）患者血液中的CTCs，有3%的患者检测到了CTCs，并且CTCs阳性者在接下来的1～4年内出现了肺结节，且手术证实为早期肺癌。Kurusu等[15]利用CellSearch技术富集分离125例肺癌患者和25例肺良性肿瘤患者外周血中的CTCs（以1个CTC/7.5ml为阈值），发现125例肺癌患者CTCs阳性率为30.6%，明显高于良性肿瘤患者的12.0%（P＜0.05）。Hoffman等[16]通过检测发现恶性疾病患者、不确定恶性疾病患者及良性疾病患者CTCs阳性率分别为83%、12%和5%，而作为阴性对照组的59例健康患者中则没有检测到CTCs。中位随访24个月后发现，CTCs 50个/10ml的肺癌患者术后无病生存期（DFS）和总生存期（OS）相较于CTCs＜50个/10ml的肺癌患者短，且差异有统计学意义（P=0.001、0.002）。Ross等[17]检测49例肺癌患者和20名健康者外周血中的CTCs，结果发现在健康者中未检测出CTCs，而肺癌组均检测到CTCs，其中5例Ⅰ期患者检测出CTCs，数值为（0.40±0.55）个，可见CTCs对肺癌诊断有帮助。

Yu等[18]研究发现，当阈值设定为8.64/3ml时，CTCs诊断肺癌的灵敏度为72.3%，特异度为84.1%，其诊断效能明显高于神经元特异性烯醇化酶（NSE）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原125（CA125）、细胞角蛋白片段抗原211（CYFRA211）及鳞状细胞癌相关抗原（SCCAg）[19]等肿瘤标志物。Chen等[20]通过检测发现在肺鳞癌患者血中SCCAg水平与CTCs数呈正相关，因此认为两者联合检测可提高早期肺癌的诊断率。Chen等[21]发现CTCs在鉴别肺部良恶性病变方面特异度高达88.65%，高于CEA、NSE、CYFRA211等常用肿瘤标志物特异度（82.39%），差异有统计学意义（P＜0.001），上述研究均表明CTCs与常见肿瘤标志物相比在肺癌的诊断上具有一定的优势。

4.2 分期相关性临床分期是制定肺癌治疗方案的主要依据，最新研究结果显示肺癌CTCs与肿瘤分期具有明显的相关性，且能显示肿瘤细胞增殖过程中的变异[22]。

Mascalchi等[23]在26例确诊为Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者的外周血中检测到CTCs 17例（65%），计数为（6.8±3.7）个/3ml。Zhao等[24]将外周血中CTCs计数2个/3.2ml定义为CTCs阳性，检测35例根治术后肺癌患者的CTCs，结果显示：CTCs阳性率Ⅰ期7.7%（1/13），Ⅱ期33.3%（2/6），Ⅲ期43.8%（7/16），差异有统计学意义（P＜0.05），结果表明CTCs阳性率与肺癌术后分期之间关系密切。Lou等[25]用LT-PCR法检测72例肺癌患者外周血中的CTCs：阈值设置为8.5个/3ml，Ⅰ、Ⅱ期癌症阳性率80%，Ⅲ期阳性率67%，Ⅳ期阳性率高达93%。Liu等[26]检测65例肺癌患者的CTCs，发现转移性肺癌患者CTCs的阳性率为83.33%，明显高于非转移性患者的43.48%，且随着转移部位个数的增多，CTCs的阳性率逐渐上升。Jia等[27]将113例入组人员分为肺癌组（50例）、良性肿瘤组（35例）和正常对照组（28例），发现CTCs计数在肺癌组明显高于良性肿瘤组和正常对照组，且CTCs计数在肺癌中与临床分期密切相关（P＜0.01）。有两项荟萃分析结果示：基线状态、治疗后外周血中存在CTCs的患者预后效果不佳，而且分期越晚，越易检测到CTCs，提示CTCs的检出率与患者分期密切相关[28-29]。

4.3 疗效评价有研究表明，CTCs在外周血中的水平与肺癌患者预后具有显著相关性[30]，因此通过实时检测CTCs的数目和分子特性可以反映病情变化，有助于指导个体化治疗，及时调整治疗方案。

Hirose等[31]评估了33例接受吉西他滨联合卡铂化疗的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者CTCs计数变化与化疗疗效之间的相关性，结果提示：化疗后CTCs阳性1个/7.5ml的患者中出现肿瘤进展的比例为66.7%，显著高于CTCs阴性者的23.8%，差异具有统计学意义（P=0.02）。Punnoose等[32]将化疗前后PET-CT结果与CTCs检测水平相比较，提示CTCs检测结果与PET-CT疗效评价结果相吻合。Hou等[33]研究发现化疗前后CTCs的变化对肺癌患者的PFS及OS有较强预测作用，CTCs数目变化与PFS、OS呈负相关。Wu等[34]观察453例肺癌患者后发现化疗后CTCs阴性患者疾病控制率（DCR）、PFS、OS均明显高于CTCs阳性患者，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

Muinelo-Romay等[35]报道了在43例晚期NSCLC患者中，分别在基线状态、治疗第2个周期及第5个周期检测CTCs，其中在基线状态CTCs 5个/7.5 ml的患者与CTCs＜5个/7.5 ml的患者相比具有较低的中位PFS（4.1个月vs 7.6个月，P＜0.05）和中位OS（4.6个月vs 10.7个月，P＜0.01），大部分患者在第2个周期化疗时CTCs含量有明显下降，提示CTCs检测既可预测患者疗效，也可以判断治疗过程中治疗方案是否有效。

李晶等[36]选取中晚期NSCLC患者分别于化疗前、2周期化疗后检测CTCs，每2个周期行疗效评估，结果提示CTCs数目评价与RECIST评价疗效比较，差异无统计学意义（P＞0.05），显示两种评价方法有较高的吻合度。

尽管目前对CTCs检测无法统一标准，但大量研究结果已证明CTCs的存在与肿瘤患者无病生存时间、无进展生存期及总生存期相关[37]。

4.4 基因检测NSCLC靶向治疗的常见靶点包括表皮生长因子受体（EGFR）、间变淋巴瘤激酶（ALK），近年来针对上述靶点的药物明显改善了NSCLC患者的预后，但耐药突变的出现严重阻碍了靶向治疗的进展。对于使用靶向药物的患者而言，实时监测耐药突变可有效地指导后续治疗，但由于肿瘤标本获取困难，大部分患者不愿选择二次活检，而CTCs因其采样简便，为实时监测治疗反应提供了可能。但CTCs中的基因突变能否能代表NSCLC原发灶及转移灶尚存在争议。

Sun等[38]在单细胞层对CTCs的EGFR的18、19、20、21外显子进行测序，检测结果与原发病灶病理组织检测结果相同。Ran等[39]检测20例组织样本阳性的肺癌患者CTCs的EGFR基因（19外显子、L858、T790M）的突变情况，其中95%的患者CTCs阳性,与病理组织检测（EGFR基因均突变）结果相近。

Pailler等[40]对18例检测组织ALK基因重排阳性和14例阴性的NSCLC患者CTCs进行分析，结果提示阳性组CTCs中均存在多个（4个/1ml）ALK基因重排，而ALK阴性组仅检测到0或1个CTCs发生ALK基因重排，因此认为检测CTCs中的ALK基因重排也可以用于指导ALK抑制剂克唑替尼的治疗。

4.5 体外培养CTCs相较于其他液体活检，优势在于可以进行体外培养，用于药敏检测。Zhang等[41]建立NSCLC细胞系，从体内体外对其生物学特征进行研究，但目前在这方面研究较少，有待进一步探索。

综上所述，CTCs因其费用昂贵、测定标准难以统一、不同检测方法差异性大等，导致CTCs至今难以广泛应用于临床，但其异质性强、标本获取简便、无创以及可重复，将越来越被人们认可，且检测外周血中CTCs对肺癌早期诊断、临床分期、疗效评价、基因检测有重要意义，能为延长肿瘤患者生存、提高临床疗效起到促进作用，期待在不久的将来CTCs的检测为广大肺癌患者带来更大的获益。

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10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-2083

上海市2016年度“科技创新行动计划”医学领域项目指南（16401970800）

200032上海中医药大学附属龙华医院肿瘤六科

刘苓霜，E-mail:liuls107@163.com

2017-08-30）

（本文编辑：马雯娜）