早竹竹叶蛋白的微波提取工艺优化

陈致印++何佳慧++许泽文

摘 要：该文以早竹竹叶为研究对象，pH7.8的磷酸缓冲溶液为提取剂，采用微波提取法，并用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量，在料液比、提取时间、提取温度、微波功率等单因素试验的基础上，进行L9（34）正交试验设计，优化了微波提取早竹竹叶蛋白的工艺参数。结果表明：各因素对早竹竹叶蛋白质的提取率的影响顺序依次为：微波时间>微波温度>微波功率>料液比。微波提取早竹竹叶蛋白的最佳工艺条件为：料液比为1∶25，微波时间为8min，微波温度为54℃，微波功率为500W，在此最佳条件下，提取率为8.07%。

关键词：早竹竹叶；蛋白质；微波

中图分类号 S795 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）24-0103-04

Optimization of Microwave Assisted Protein Extraction from Phyllostachys praecox Bamboo Leaves

Chen Zhiyin et al.

（College of Agriculture and Biotechnology，Hunan University of Humanities，Science and Technology，Loudi 417000，China）

Abstract：Taking the leaves of Phyllostachys praecox bamboo as material，phosphate buffer solution as extract solvent，and the protein content was determined by Coomassie Brilliant Blue Staining. On the basis of single factor tests of solid-liquid ratio，microwave time，microwave temperature and microwave power，L9（34）orthogonal experiment was used to optimize the extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves. The results showed that the effect of the investigated factors on the extraction yield of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein was in sequence of microwave time，microwave temperature，microwave power，solid-liquid ratio.The optimum conditions of microwave-assisted extraction of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein were：solid-liquid was 1∶25，microwave time was 8min，microwave temperature was 54℃，microwave power was 500W. Under these circumstances，the extraction rate of Phyllostachys praecox bamboo leaves protein reached 8.07%.

Key words：Phyllostachys praecox bamboo leaves；Protein；Microwave

早竹（Phyllostachys praecox）为禾本科刚竹属植物，笋期在3月下旬至4月上旬或更早，故称为早竹。经周兆祥研究[1]发现早竹竹叶中含有机酸、酚类化合物、蛋白质、多糖等有机物，且富含钙、硅等矿物元素，其丰富的化学成分使其具有抗氧化、抗衰老、调节血脂等[2]生物功能。目前对早竹竹叶的研究大多数侧重在糖类、叶绿素、黄酮、竹叶的抗氧化活性及天然竹叶饮料[3]等方面，而关于竹叶蛋白则少有研究，近年竹叶蛋白被发现有抗菌[4]、防霉、防腐[5-6]等功能，如何提高竹叶蛋白质的提取率，成为了近年来研究的热点。本文以早竹竹叶为试材，以料液比、微波时间、微波温度和微波功率为考察因素，研究微波提取方法对早竹竹叶蛋白得率的影响，以期为工业开发竹叶蛋白提供理论依据[7]。

1 材料和仪器

1.1 材料 早竹竹叶粉由采摘自娄底人文科技学院毓师园的早竹竹叶晾干制成粉，过80目筛。蒸馏水、磷酸氢二钠（分析纯）、牛血清白蛋白（生化试剂）、硼酸、溴甲酚绿：国药集团化学试剂有限公司、磷酸二氢钠（分析纯）：湖南汇虹试剂有限公司、氢氧化钠：天津市化学试剂工厂、硫酸钾：台山市粤侨试剂塑料有限公司、硫酸铜：国药集团化学试剂有限公司、无水碳酸钠：西陇化工股份有限公司、盐酸：衡阳市信凯化工试剂、浓硫酸：湖南汇虹试剂有限公司、考马斯亮蓝G-250：天津市光复精细化工研究所、无水乙醇：湖南汇虹试剂有限公司、溴甲酚绿：国药集团化学试剂有限公司、甲基红：天津市光复科技发展有限公司。

1.2 仪器 101型电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司、XEB-400型高速中药粉碎机：吉首市中诚制药机械厂、UVmini-1240岛津紫外可见分光光度计、KDN系列凯氏定氮仪、Multwave PRO安东帕微波消解仪、SHIMADZU AUW120D十万分之一分析天平、SHZ-DⅢ循环水真空泵：郑州英峪予华仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 工艺流程 工艺流程如下：采集新鲜的早竹竹叶→洗净晾干、在45℃的鼓风干燥机中烘24h→中药粉碎机打粉→过80目筛→早竹竹叶样品→PBS磷酸缓冲溶液浸泡0.5h[8]→微波提取→过滤→考马斯亮蓝法测定吸光度→计算蛋白质得率。

2.2 单因素试验 称取早竹竹叶粉1g，以pH 8.4磷酸缓冲液为提取剂，按料液比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35添加磷酸缓冲液，温度分别为46℃、48℃、50℃、52℃、54℃，微波时间分别为2min、4min、6min、8min、10min，功率分别为200W、300W、400W、500W、600W的情况下，浸泡0.5h，过滤，得滤液，在595nm下用紫外分光光度计测吸光度，测定蛋白质得率。

2.3 正交试验 在单因素的基础上，采用L9（34）进行正交实验，进一步研究料液比、温度、时间、功率的变化对蛋白质提取率的影响。

2.4 蛋白质的测定

2.4.1 牛血清蛋白标准曲线的绘制 称取100mg牛血清蛋白，用蒸馏水配置成1 000mg/mL标准蛋白质溶液，取6支10mL干净的具塞试管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准蛋白质溶液，用蒸馏水补充至1mL，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，摇匀，反应2min，用1cm比色皿在595nm下测定吸光度A，绘制标准曲线[9]。

2.4.2 早竹竹叶中蛋白质总含量的测定 采用凯氏定氮法测定蛋白质总含量[9]。

2.4.3 早竹竹叶蛋白提取率的测定 计算公式如下：提取率（%）=提取蛋白质的质量/蛋白质的总质量×100

3 结果与分析

3.1 牛血清蛋白标准曲线的制作 在595nm波长下测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标、牛血清蛋白浓度（x）为横坐标，得出标准曲线（图1）及回归方程：A=0.7646x-0.008，R2=0.999 1。

3.2 蛋白质总含量 用凯氏定氮法测定蛋白质含量，测得早竹竹叶中的蛋白质含量为10.757%。毛燕、王学利[10]等利用凯氏定氮法研究过9种竹叶中的蛋白质的含量，结果表明这9种竹叶中蛋白质平均含量为13.6%，不同品种的竹叶蛋白质含量差异也较大，其中白哺鸡竹叶的蛋白质含量高达18.25%，石竹的蛋白质含量为10.81%，金竹的蛋白质含量为10.63%，芽竹的蛋白质含量为10.88%。与本试验测定的10.75%数值相近。

3.3 单因素试验结果

3.3.1 料液比对蛋白质提取率的影响 不同的料液比对早竹竹叶蛋白的提取效果不同，从图2可以看出，在1∶15～1∶25蛋白质提取率有较大的提升，当料液比过大时，溶剂太少，浸提不够充分，可能有部分蛋白质没有溶解，影响提取率，而随着溶剂的增加，体系在中的粘度降低，便于蛋白质溶解；1∶25时蛋白质的提取率达到最大，为7.51%；当料液比的比值继续下降时候蛋白质的提取率反而下降，这可能是因为溶剂的量过大，导致蛋白浓度下降。

3.3.2 提取温度对早竹竹叶蛋白质的影响 从图3可以看出，随着提取温度的升高早竹竹叶蛋白的提取率逐渐增高，这是因为随着温度的增加，体系中的熵值增加，蛋白质加速溶解和扩散，当温度达到52℃时，蛋白质的提取率达到最高，为6.76%。随着温度的继续增加早竹竹叶蛋白的提取率反而下降，可能是温度过高导致蛋白质水解。因此，提取温度以52℃左右为宜。

3.3.3 时间对蛋白质提取率的影响 由图4可知，从2～4min，早竹竹叶蛋白的提取率迅速上升，在4min时达到提取率的峰值，为7%；随着时间的延长，蛋白质的提取率缓慢下降。这说明在第4min时，蛋白质的提取基本完成，继续微波会导致蛋白质水解、变质，且长时间的微波会使水分过分蒸发，导致蛋白质的溶出减少，反而使得率缓慢下降，故选取4min、6min和8min进行正交试验。

3.3.4 提取功率对蛋白质提取率的影响 由图5可知，从200W开始随着功率的增加早竹竹叶蛋白质的提取率缓慢上升，到400W时，蛋白质的提取率达到最大为6.946%，而后随着提取功率的增加，蛋白质的提取率逐渐下降，这可能是因为微波处理技术是将微波电磁能转化成热能，利用微波整体受热的特点，促使细胞膜破裂，加速蛋白质的渗透及溶解。当功率过高时，受热过快，易导致蛋白质的分解，且受热过快，易导致暴沸，使得提取物粘连在管壁上，影响到蛋白质溶解在溶液中，故提取功率为400W。

3.4 正交实验 根据单因素的试验结果，设计（L9（34））正交表，详见表1（表2）。由表2可知，根据极差的数值大小，可知微波法提取早竹竹叶蛋白质中，各因素对早竹竹叶蛋白质的影响大小顺序为微波时间>微波温度>微波功率>料液比，微波时间对蛋白质的影响最大，在提取时间8min时，蛋白质的得率最高。这可能是因为微波对细胞壁有穿透作用，且微波附带着的热量能使蛋白质溶解在溶剂中，随着微波时间的增加，物质吸收的波能越多，固液传质的速度越快，即更多的蛋白质溶解在提取介质中。综合各因素的作用，微波法提取早竹竹叶蛋白的最佳条件是A1B3C3D3，即在料液比为1∶20，微波温度为54℃，微波功率为500W的条件下微波8min，蛋白质的提取率为8.07%。

3.5 验证试验 为验证所选工艺的稳定性和可重复性，精确称取1.00g早竹竹叶粉末，在最佳提取工艺参数下进行3次平行验证试验，得出蛋白质的平均提取率为8.03%，RSD值为0.56%。表明该工艺稳定可行。

4 结论与讨论

通过本试验确定了微波法提取早竹竹叶蛋白的最佳工艺参数，通过单因素试验法确定了料液比、温度、时间和功率4个因素的取值范围，并得出影响蛋白质提取率的因素大小为微波时间>微波温度>微波功率>料液比，正交试验得出最佳工艺参数组合：料液比为1∶20，温度为54℃，功率为500W，微波时间为8min，早竹竹叶蛋白质的提取率为8.07%。实验结果低于陈学仕等[11]利用微波法提取茶叶蛋白质的提取率11.26%以及扶庆全等[12]利用微波辅助提取红豆蛋白的提取率93.56%，这可能是因为实验材料不同，也可能是因为在扶全庆等进行试验时将pH作为单因素，而本试验没有将pH的影响考虑在内。

参考文献

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[2]李飞跃，喻国光，陈金珠.竹叶主要化学成分分析及其生物活性研究现状[J].江西林业科技，2006（4）：34-36.

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[10]毛燕，王学利.毛竹等九种竹叶中蛋白质和总糖含量的测定[J].竹子研究汇刊，1998，17（2）：17-20.

[11]陈仕学，罗承琼，卢忠英.微波辅助提取茶叶蛋白质的工艺及其性质研究[J].湖北农业科学，2015，54（18）：4552-4556

[12]扶全庆，张李阳，徐鉴.微波辅助提取红豆蛋白的研究工艺[J].食品工业，2012（2）：71-73. （责编：张宏民）