杜 清,许晓辉,林鹏程,卢永昌,叶 菊(青海民族大学药学院,青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海省药物分析重点实验室,青海西宁80007;兰州市食品药品检验所,甘肃兰州70000)
·综述·
植物多糖的研究进展及开发前景
杜 清1,2,3,许晓辉4,林鹏程1,2,3,卢永昌1,2,3,叶 菊1,2,3(1青海民族大学药学院,2青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,3青海省药物分析重点实验室,青海西宁810007;4兰州市食品药品检验所,甘肃兰州730000)
植物多糖是普遍存在自然植物界,由许多相同或不同的单糖以α⁃或β⁃糖苷键所组成的一类大分子化合物.多糖是一类重要的信息分子,在有机体中参与多种生命活动.本文从提取分离、脱色纯化、分析测定、构效关系、药理作用、生物学功能等方面综述了植物多糖的研究及开发利用情况,阐述其作为治疗药物的主要成分在当前临床上所发挥的重要作用,为进一步深入研究开发更多有价值的植物多糖产品提供借鉴.
植物多糖;提取纯化;分析测定;药理作用;构效关系;应用前景
多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖,由10个以上相同或不同的单糖分子通过糖苷键聚合、脱水形成的多羟基聚合物,来源于高等植物、藻类、菌类及动物体内,根据现有的研究情况可分为植物多糖、细菌多糖、真菌多糖和动物多糖,是自然界含量最丰富的生物聚合物[1].植物多糖参与细胞的各种生理活动,且具有多种药理作用及生物学功能.随着分子生物学、细胞生物学等相关学科及仪器技术的发展,国内外对植物多糖的复合物及化合物的研究也日渐深入.通过对植物多糖的提取分离、脱色纯化、含量测定、组分分析、构效关系、药理作用及生物学功能等研究内容的分析,需要研发、临床及生产经营企业各个阶段人员的共同努力和配合来开发更多与植物多糖相关的产品.
在对植物的根、茎、叶、皮、种子和花等各个组织的化学成分研究过程中,研究者常会关注其多糖类成分并进行常规的研究.从中草药、天然植物中可以提取分离出结构异同的各类多糖,并发掘其化学结构、功效及应用之间的关联性.国外像美国、日本[2]、欧洲、韩国对植物多糖的研究出现在20世纪50、60年代[3],且已有不少植物多糖的专利和前沿文献的发表[4].在我国,王章姐等[5]、赛德艾合买提[6]在文中提到对黄芪多糖[7]、当归多糖[8]、灵芝多糖[9]、人参多糖[10-11]、香菇多糖[12]、甘草多糖[13]等进行了深入的研究.
2.1 提取
2.1.1 组成和性质 多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成,是一类分子结构复杂且庞大的物质.凡是符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖,有匀多糖和杂多糖之分.多糖大部分为无定形粉末,没有甜味,熔点各不相同,不易溶解于水,难溶于醇、醚、氯仿、苯等有机溶剂中.
2.1.2 提取原则 根据多糖的基本组成和性质从不同的植物中提取多糖,因其细胞或组织外大多有脂质包围,要使多糖释放出来,首先要除去表面脂质,因此在提取之前需进行预处理,可根据植物种属和性质通过预实验选择性的使用石油醚、乙醚、丙酮、乙醇、甲醇或1∶1的乙醇乙醚混合液等有机溶剂提取,除去部分色素、脂肪酸等脂溶性杂质,用不同浓度的乙醇除去单糖、低聚糖和苷类等干扰性成分,然后根据不同溶解度选择一种溶剂进行萃取,一般应用水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂[14-15].
2.1.3 提取方法 目前常见多糖的提取方法有化学提取法,包括水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法、醇提法和超滤膜法;酶解法包括单一酶解法和复合酶解法;物理强化法包括括微波辅助提取法、超声波辅助提取法和高压脉冲法;微波协同酶法及超临界流体萃取法等.在提取过程中,根据不同科属植物多糖的性质,综合运用以上技术,不仅仅要考虑到粗多糖的得率,还要考虑到不破坏多糖的结构等重要因素[15-20].
2.2 除蛋白去部分醇溶性杂质得到的粗多糖,常含有无机盐、蛋白质、色素及醇不溶的小分子有机物等杂质,用sevag法、三氟三氯乙烷法或三氯醋酸法脱去游离蛋白质,用蛋白酶除去结合蛋白质,用透析法除去小分子杂质和蛋白质.至此,得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的较纯净的多糖混合物.
李知敏等[21]通过实验以多糖损失率和脱蛋白率(r)为衡量指标,通过对三氯乙酸法、盐酸法及sevag法脱蛋白方法的比较,优化出植物多糖提取液的脱蛋白方法,为多糖的纯化提供了一定的参考.
2.3 脱色多糖提取液大多较粘稠且颜色较深,为褐色、黄色或红色等,植物多糖可能含有酚类化合物而颜色较深,对多糖的定性定量分析及结构测定具有很大的影响,因此脱色对多糖后续的研究至关重要.常用的脱色方法有:活性炭法、H2O2法、树脂法、Al2O3柱层析法、聚酰胺法和静态混合器法[22].
2.4 分离纯化多糖难溶于有机溶剂,故采用乙醇或丙酮分级沉淀、反复溶解等多级分离方法,获得各物理常数恒定的粗多糖,再将粗多糖混合物纯化后分离成单一的多糖[23],主要方法有:分部沉淀法、盐析法、金属络合物法、季胺盐沉淀法、离子交换柱层析法、凝胶柱色谱法、制备区域电泳、超滤、亲和层析、膜分离法、制备性高压液相色谱(HPLC)等[24-25].灵芝多糖应用新型的径向离子流方法祛除蛋白质和色素来获得分离纯化后的多糖产物[26].
3.1 纯度检查不同植物多糖其性质各异,对其纯度检查的方法有:比旋度法、超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、纸层析法、冻融法和光谱扫描法[27].
3.2 定性检测植物多糖的性质检测主要包括其理化性质,比如溶解性、比旋光度、特性粘度、电导率及PH值等;红外光谱(IR)分析,用于不同糖的鉴别、糖苷键及糖构型的确定、糖键上主要取代基的识别等;核磁共振(NMR)来鉴别多糖,糖的核磁共振波谱主要是1H、13C核磁共振波谱,多糖在1HNMR谱图上,大多集中在δ4.0~5.5 ppm范围内,而13CNMR主要应用于多糖结构,高磁场NMR方法能产生较完全和详细的结构信息[28].
3.3 分子量测定常用的分子量测定方法有:渗透压法、超离心法、高压电泳法、聚合度法、蒸气压法、还原末端法、光散射法、粘度法、凝胶过滤法、高效液相色谱法、超过滤法、凝固点下降法、基底辅助激光解吸电离质谱法[28].
植物多糖的定量分析方法很多.目前主要采用比色法等对总多糖进行测定,探讨各种植物多糖的分析方法,比较其各类分析方法的优缺点.
主要有光学分析法,常采用苯酚⁃硫酸法、蒽酮⁃硫酸法和DNS法,利用分光光度法对多糖进行定量,所选方法需先进行方法学研究,对糠醛缩合显色法的测定条件进行研究,用正交实验优选出合适的实验条件和方法[29-30].可根据植物多糖的性质选择不同的测定方法进行比较,采用硫酸⁃苯酚法,硫酸⁃蒽酮法比较显色反应后吸收曲线的稳定性,不同单糖对照品显色反应后最大吸收波长不同,其中硫酸⁃苯酚法显色反应后稳定性较好[31-32].
同一种方法根据多糖的性质以及实验条件进行优选及改良,比如对苯酚⁃硫酸法的测定条件进行了改进,利用在改进的测定条件下测得的各种单糖的校正系数,可以以葡萄糖为标准品对组成己知的寡糖或多糖的含量进行测定[33].
含量测定方法还包括色谱分析法,如薄层色谱法,高效液相色谱法、气相色谱法和气质联用法、凝胶色谱法和离子交换色谱法、高效毛细管电泳法;应用酶法、重量测定法等[34].
当归多糖应用HPLC⁃柱后荧光衍生法测定壳聚糖酯[35]、麦冬多糖[36],还建立了FITC预标记的HPGPC⁃FD检测方法[37].
粗多糖的样品经过水解后分析其中单糖的组成成分及组成比例.主要的分析方法有:酸完全水解、部分水解法、碱降解法、高碘酸氧化和Smith降解法、甲基化反应、酶降解、薄层色谱、高效液相色纸层析、薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱法(gas chromatography,GC)、毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)、质谱解析、x⁃射线纤维衍射、气相⁃质谱联用、核磁共振光谱(nu⁃clear magnetic resonance,NMR)、红外光谱和拉曼激光光谱等[38-39,40].
多糖发现有多种药理作用[41],可通过增强免疫力、抑制肿瘤血管新生、诱导癌细胞分化与凋亡、抗突变与恢复细胞间通讯、改变细胞膜流动性及细胞膜泵的活性和直接作用于细胞来起到直接或间接的抗肿瘤作用[42-43];多糖具有免疫调节作用,通过增强免疫器官、体液、细胞的功能、促进细胞因子的生成、免疫抑制和增强的双向调节机制及抗补体与补体激活来调节机体免疫系统[44-45];多糖对心血管系统具有降血糖、降血脂、抗凝血和抗血栓、抗心肌缺血的作用[44,46-47];多糖具有抗病毒及抗肝纤维化活性、抗氧化、抗自由基损伤、抗衰老、抗辐射作用,通过直接抗病毒、提高氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化,从而保护生物膜的作用[48-49];多糖通过调节炎症细胞分泌炎症介质,平衡炎症部位的促炎因子与抗炎因子的水平来达到抑菌抗炎,清热利胆的作用[50-51].
多糖的生理功能可关联到许多细胞、组织及器官重要的生命进程.多糖作为营养基质结合、吸收外源性病原菌,促进机体肠道内健康微生物菌相的形成.多糖可调节肝脏细胞中的ALT和AST水平,降低TNF⁃α、IL⁃1等炎症介质,影响肝中一氧化氮和一氧化氮合酶的含量,调节外周血淋巴细胞亚群来治疗因免疫造成的肝脏损伤疾病[52].各种植物中提取出的水溶性多糖对可促进神经细胞的增殖、分化、抑制凋亡并具有损伤修护的作用,可用来治疗老年神经性疾病[53].
发现多糖复合物的多种生物活性后,因多糖结构不同,生物活性会有差异[54].找出它们之间的规律性,就可更全面的解释多糖化学结构和生物活性之间的关系,为更好的寻找具有生物活性的多糖、多糖药物、多糖功能性食品及开发其替代品.
多糖具有一级结构和高级结构.多糖的一级结构包括单糖的组成连接方式糖苷键类型、分支度及官能团等,每一因素对多糖的生物活性都有不同程度的影响.多糖的二、三、四级结构还在继续开发中.活性多糖发挥作用都需要特定部位同受体结合,即活性部位影响其生物活性.多糖的结构和性质影响其活性的强弱,需结合机体本身的免疫功能状态和抗原的差异性,来具体分析其各个方面的应答水平及与机体平衡的对比度,由此检测多糖的活性和作用[55].比如香菇多糖,裂褶多糖均具有1→3⁃β⁃D葡聚糖主链和葡聚二糖支链结构且具有活性的三股螺旋空间构象,二者都具有抗肿瘤作用及提高细胞免疫及体液免疫功能[56-58];牛膝多糖硫酸化得到牛膝多糖硫酸酯,有抑制乙肝病毒HBsAg、HbeAg和I型单纯疱疹病毒的活性[59];灰树花多糖硫酸化形成灰树花多糖硫酸酯后,对人胃癌细胞SGC⁃7901有直接杀伤作用[60];海带褐藻多糖硫酸酯对超氧阴离子具有良好的清除作用,能够抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血,对FeSO4⁃抗坏血酸体系造成的脂质过氧化具有良好的保护作用[61];茯苓多糖经磺酰化后的磺酰化新茯苓多糖具有良好的抗肿瘤活性[62];烷基化对硫酸多糖的抗HIV活性有促进作用,可能是因为烷基部分有类似表面活性剂的性质,可与HIV囊膜脂双层反应而破坏其囊膜[63].多糖的生物活性也与其分子量大小有关,硫酸化多糖的分子量在5000⁃50万范围内抗HIV活性随分子量增大而增大[64].
植物作为一种自然界天然存在的生物,其在生态方面起着重要的作用.植物多糖作为其中的活性化合物,在沙漠治理、重金属解毒、废水处理、防御病原体等方面起着重要的作用.植物多糖在医药领域可用于制备人工血液、药物缓释剂、人工皮肤或医用透析膜;可开发成多糖疫苗、抗肿瘤和免疫促进、抗病毒、降血糖、抗凝血、抗溃疡等活性的药物[65].可开发出保健食品、饮料口服液、营养强化剂等[66].此外可作为果蔬的涂漠剂及可食剂的包装材料,工业上的凝聚剂、润滑剂和水滞留剂.
现代研究中,单糖、多糖及糖复合物生物学在英国、美国、日本等国家研究迅速[67],其中日本对其研发十多年的多糖相关科研成果申请专利保护其科技成果[68].天津药业生物技术有限公司从中草药材中提取出了纯度达98%以上的活性多糖,并以药材甘草、枸杞[69]为主开发了以多糖为主要成分的“康奇胶囊”,能高效调节机体的免疫力[70].
对植物多糖的开发,随着新科技的不断更新,采取不同的提取条件,可改善提取多糖的性状、提取纯化的工艺,且发明纯化多糖的新设备、新材料,提高植物多糖提取的效率,为植物多糖产品的试制及生产奠定基础.
应用微生物发酵法、酶法、植物细胞培养等生物方法完成活性多糖的提取分离、结构修饰及合成等制备过程,已呈现出明显的优势,因为其条件温和,反应产物单纯和能耗少,故该绿色环保、高效的方法制备活性多糖在今后会得到广泛的应用[71-72].
植物多糖虽然只是大千世界物质的一种,而与其相关的科学知识、各种技术及各种物质之间的关联确是千丝万缕,相信随着植物多糖的开发及各种关联科技在化学,药理学,生物学,临床医学研究者等相关人员的共同努力和配合下,会不断推进植物多糖国内外的研发、交流及应用,并在21世纪生命科学领域的研究中开拓新前景.
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Research progress and developmental pros⁃pect of plant polysaccharide
DU Qing1,2,3,XU Xiao⁃hui4,LIN Peng⁃Cheng1,2,3,LU Yong⁃Chang1,2,3,YE Ju1,2,3
1College of Pharmacy,Qinghai Nationalities University,2Key Laboratory of Plant Resources of Qinghai⁃Tibet Plateau in Chemical Research,3Key Laboratory of Drug Analysis in Qinghai Province,Xining 810007,China;4Lanzhou Institutes for Food and Drug Control,Lanzhou 730000,China
Plant polysaccharides commonly exist in the nature.They are combined in the form of alpha⁃or beta⁃glycosides from many same or diverse monosaccharides.Polysaccharides are important informational molecule and take part in various life activities of organism.We summary the studying and developmen⁃tal utilization from the different aspects of abstraction extraction and separation,discoloration and purification,analytical determi⁃nation,structure⁃function relationship,pharmacological action,biological function and elaborate the important function of plant polysaccharide as the main ingredient when it is used as the thera⁃peutic drug in the clinic.We hope it can provide the successful experience for further developing the more valuable products relat⁃ed to the plant polysaccharides.
plant polysaccharide;extraction and purification;analytical determination;pharmacological action;structure⁃function relationship;application prospect
Q53
A
2095⁃6894(2017)04⁃78⁃05
2016-12-30;接受日期:2017-01-16
青海省科技厅重点实验室发展专项(2015-Z-Y09);青海省基础研究计划项目(2016-ZJ-712);青海民族大学高层次人才项目(2016XJG04)
杜 清.博士,执业药师,中级制药工程师.
E⁃mail:bjdfydq@163.com