鼠衰老模型的建模方法概述*

孙 凯 蒋伟文

·综述·

鼠衰老模型的建模方法概述*

孙 凯 蒋伟文

鼠衰老模型可分为自然衰老模型和人工衰老模型两类。本文通过回顾鼠自然衰老模型、D-半乳糖致衰老模型、β淀粉样蛋白注射致衰老模型、快速老化小鼠模型、γ射线照射致衰老模型、臭氧损伤致衰老模型、去除胸腺致衰老模型和转基因致衰老模型等方法，详细阐述了各方法的原理、建模方法、评价指标和优缺点，为不同目的的研究提供了参考依据，为口腔黏膜衰老模型的建立提供借鉴。

鼠衰老模型；评价指标；优缺点

衰老又称老化，是指生殖后期发生的降低机体健康水平和维持自身内稳态能力的退行性改变[1]。衰老是一个极其复杂的过程，随着年龄的增长，人易罹患糖尿病、高血脂、高血压、动脉粥样硬化、营养不良等全身疾病。同时，在口腔中则会发生上皮萎缩、角化减少、弹性降低、腺体分泌功能降低等表现，易产生感染、口干症等口腔疾病。目前，针对全身衰老的研究是国际研究的热点，鼠全身衰老模型也已较为成熟，然而，国内外尚无针对口腔黏膜衰老的动物模型。本文将对鼠各种全身衰老模型作一综述，为口腔黏膜衰老模型的建立提供借鉴。

1.自然衰老鼠模型

自然衰老鼠模型是指将鼠饲养在动物实验室，直至所需的年龄[2]。目前，大鼠和小鼠是最常用的自然衰老模型的实验动物。建模时，将1-2月龄小鼠或3-5月龄大鼠饲养在动物实验室，小鼠12-24月龄为老年期，大鼠衰老早期为21-26月龄，衰老晚期为30-32月龄[2]。另外，沙鼠也可建立自然衰老的模型[3]。

自然衰老小鼠的评价指标包括抗疲劳能力、常压耐缺氧能力、T淋巴细胞转化率和溶血素水平(降低)，Y迷宫智力测验及跳台智力测验的错误反应率(升高)。小鼠自然衰老后，抗应激能力和免疫功能降低，学习记忆功能减退。

理论上，自然衰老鼠模型具有最符合人类衰老特点的优点，并且可省略给药或手术的步骤，避免在此过程中可能发生的意外情况，但这一模型存在一些不足：如老年鼠难以得到，其来源不统一、饲养周期长、价格昂贵、健康状况差，死亡率高，在药物吸收、代谢、分布上的变异性大。因此，鼠的人工衰老模型被广泛采用进行研究。

2.人工衰老鼠模型

人工衰老鼠模型是指用人为因素致衰老所构建的鼠模型[2]，主要方法包括D-半乳糖(D-galactose，D-gal)给药法、β淀粉样蛋白(amy loid β-protein, β-AP)注射法、快速老化小鼠(sensecence accelerated mouse,SAM)、γ射线照射法、臭氧损伤法、去除胸腺法和转基因法等。其中，SAM是一种人工衰老的模式动物，可用于快速衰老的研究。

2.1 D-gal给药法 D-gal给药致鼠衰老的机制不明，有糖代谢紊乱学说、自由基氧化损伤学说、半乳糖醇中毒学说、羰基毒化衰老学说等。目前可能的一种解释是当D-gal在体内可使半乳糖浓度增高，从而增加了不能被细胞进一步代谢的半乳糖醇的浓度，其堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀、功能丧失和代谢紊乱，导致衰老的发生[3]。

建模时，首选雄性SD大鼠，亦可选用W istar大鼠或昆明小鼠等[3]。给药方式包括皮下注射、腹腔注射或口服给药，考虑到腹腔注射对肝脏的毒副作用，腹腔注射较少采用[4]。给药剂量无统一规定，一般剂量范围从50-500mg/kg·d不等，连续给药6-8周[5]，徐智等用125mg/kg·d的D-gal剂量皮下注射40天，得到了相当于24个月龄大鼠的模型[6]。崔美芝等用500 mg/kg·d的D-gal腹腔注射雄性W istar大鼠连续56天，得到了相当于20个月龄大鼠的模型[7]。吴克芬等认为采用D-gal 120-125mg/kg·d连续皮下注射6-8周建立衰老动物模型是较为可靠、稳定的[4]。王少康等用腹腔注射法对老鼠连续给药56天，水平接近自然衰老鼠[3]。李春海等以700mg/kg·d的剂量给NIH小鼠和W istar大鼠口服D-gal，连续40天，发现口服D-gal同样可以获得与注射相似的致衰老效应[8]。

目前，D-gal给药致衰老鼠模型应用广泛。Liao等将D-gal在8周龄C57BL/6小鼠的腹腔内注射建模，用于雄性生殖系统衰老的研究[9]。Hu等将3月龄SD大鼠皮下注射D-gal建模，在此基础上采用人参皂苷Rg1局部注射，用于骨髓基质细胞和造血微环境的抗衰老研究[10]。Chen等在雄性SD大鼠皮下注射D-gal，从而对增龄性中枢听觉系统改变的潜在原因进行研究[11]。Gao等在SD大鼠皮下注射D-gal，构建阿尔兹海默病的模型，在此基础上使用红景天苷，探究阿尔兹海默病可能的发病机制[12]。Budni等将4月龄W istar大鼠口服给药观察其大脑前额皮质和海马体线粒体呼吸链的变化[13]。

D-gal给药法构建的衰老鼠模型的评价指标包括(1)外观特征：体重(是否下降)、毛色(是否枯黄)、行动(是否迟缓)、精神(是否萎靡)；(2)血液、组织生化指标：血清、红细胞、脑、肝组织中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、单胺氧化酶 B (monoam ine oxidase B,MAO-B)、脂质过氧化物(lipid perox ide,LPO)(是否增高)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力(是否降低)；脑、心、肝中脂褐素含量；血糖、血清胆固醇；(3)脏器指数：如胸腺指数、脾脏指数；(4)行为学检测：Y型迷宫试验、水迷宫试验、兴奋性试验、跳台被动回避试验等；(4)形态学研究：大脑皮层的神经病理学变化；(5)分子生物学检测：内耳组织线粒体DNA、端粒酶活性等[5]。

D-gal所致衰老鼠模型具有价格低廉、结果稳定的优点，成模时间较自然衰老鼠模型短，但又较臭氧方法时间长，需实验者每天给药，较为繁琐，同时与自然衰老鼠在某些指标上仍有一定差异，在应用时应根据实际情况选择评价指标。

2.2 β-AP注射法 β-AP是一种阿尔茨海默病的特异性蛋白，与阿尔茨海默病的病理形成过程密切相关。有证据表明，双侧海马内单次注射β-AP可引起大鼠学习记忆功能下降。若在D-gal所致动物模型基础上，海马内注射β-AP可望成为一种更佳的研究阿尔茨海默病的鼠衰老模型[14]。然而，β-AP注射法所致衰老鼠模型仅适用于对阿尔茨海默病的研究。

2.3 SAM SAM小鼠在日本东京大学首次培育成功，目前共有12个亚系，是一种经典的模式动物。快速衰老小鼠各亚系的主要特征包括免疫功能低下、肺部病变、变形骨关节病、主动脉形态结构异常及中膜轻度钙化、衰老及学习记忆能力减退、白内障、脑萎缩的学习记忆及情感障碍等[15]。M ikulski等利用SAM的P系(SAMP)小鼠发现了肠炎的发病与CCL21的缺失和树突状细胞的免疫功能缺损有关[16]，Menghini P等则进一步利用SAMP1小鼠研究了结肠肿瘤与肠炎的关系[17]。SAMP小鼠与许多人类老年性疾病的病理改变相似，同时，小鼠遗传信息极为丰富，为衰老的研究奠定了实验基础，但其价格昂贵，存在基因缺陷，来源不足。实验者应根据研究具体条件选择。

2.4 γ射线照射法 γ射线致衰老模型利用γ射线对机体产生的多种自由基来攻击生物膜。同时，辐射也能使氧化酶和非氧化酶活性系统的防御机制减弱，白细胞总数和血红蛋白明显降低，从而加速衰老的发生[2]。

建模时，可采用10月龄雄性SD大鼠连续照射γ射线5天，吸收剂量为3.0Gy，即控制辐照面积为25cm×25cm，照源距大鼠的高度为80cm，每次辐射4分53秒。李云等用该方法建模，选用SOD、MDA作为评价指标，发现γ射线照射SD大鼠在照射5天后，SOD显著下降，MDA显著上升，等效于采用40mg/kg·d连续40天颈背部皮下注射D-gal的致衰老效果[18]。γ射线致衰老法简便易于掌握，但γ射线具有极强的穿透能力，误操作对人体将造成一定的危险，在一般实验室难以获得，同时，γ射线致衰老模型的评价指标也较为有限。

2.5 臭氧损伤法 臭氧作为强氧化剂，在常温下能与任一种有机分子作用产生超氧阴离子自由基，使细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化物链反应，其产物作用于蛋白质分子及某些酶，使它们的生物活性受到影响，最终导致细胞变性死亡，促进组织衰老[2]。

建模时，选用雄性W istar大鼠或NIH小鼠。将鼠放置于1.9mg/m3的臭氧浓度的臭氧柜中生活，每天给水、饲料、换垫料，观察其活动情况。如选用NIH小鼠，则在臭氧柜中生活10-20天[2]。如选用雄性W istar大鼠，则在臭氧柜中生活21天。到达时间后，在鼠股动脉采血称重后处死，取出胸腺和脾脏，用电子天平称重，计算相应脏器指数[7]。Gao等运用8周龄C57BL/6小鼠，臭氧照射后建模，检测了KL蛋白在呼吸道上皮中的表达，并用于慢性阻塞性肺病的研究[19]。Lim则采用年轻的8周龄无毛小鼠和18月龄年老的SKH-1无毛小鼠，经臭氧照射后，用于皮肤伤口愈合情况的研究[20]。

臭氧致衰老鼠模型的评价指标包括血清SOD活性、MDA含量、血糖、胆固醇、脏器指数和耐寒能力[7]。臭氧致衰老模型的优点在于简单易行，节约人力，时间较D-gal致衰老和自然衰老模型短，但需经常用臭氧检测管测量臭氧柜内的臭氧浓度。

2.6 胸腺摘除法 胸腺是免疫系统的中枢器官，又是免疫细胞的生成场所。胸腺激素由胸腺上皮产生，其主要功能是诱导T淋巴细胞的分化成熟、增强细胞免疫反应调节机体免疫平衡[21]。当胸腺摘除后，导致细胞免疫功能低下、缺损可加快衰老。

建模时，将3月龄W istar大鼠麻醉后仰卧固定，沿胸骨正中线纵行切开皮肤1.0cm-1.5cm，用眼科镊子分离皮下组织，再用眼科组织剪从颈部向下沿胸骨正中线纵行剪开胸骨至第2肋间，暴露胸腺，小心剥离并取出胸腺，然后立即缝合，并滴加青链霉素，继续饲养至6月龄[7]。有学者构建了去除胸腺的B6小鼠，研究了调节性T细胞与传统T细胞的平衡关系[22]。Morel等利用胸腺摘除小鼠探索了以基因治疗恢复先天性无胸腺或胸腺功能低下者内分泌功能的可能[23]。Lanzer等运用胸腺去除鼠制作衰老模型，研究了其CD4T细胞的多样性及其对流感病毒的反应[24]。

胸腺摘除致鼠衰老模型的评价指标包括测定血清SOD活性、MDA含量、血糖、胆固醇，计算脏器指数，观察耐寒能力等。该方法仅需在大鼠3月龄时行一次胸腺摘除手术，后续常规饲养，不需过多的人力、物力，但初学者易造成动物死亡，反而所需时间更长。

2.7 转基因法 APP转基因小鼠、CRH敲除小鼠和Sod2杂合子敲除小鼠可分别用于作为阿尔茨海默病病理作用、糖皮质激素作用和氧化应力理论研究[2]。

综上所述，鼠衰老模型是人类研究衰老机制的有效途径工具。然而，各衰老的老鼠模型有其各自优缺点，且所研究侧重点各有不同，研究者应根据不同的实验经费、实验设备、实验周期和研究目的选择和构建所需要的模型。同时，经过查阅文献，我们并未发现专门研究口腔黏膜衰老的鼠模型，所涉及的以上衰老模型也未涵盖口腔黏膜方面的评价指标，将来研究者可以向这一未知领域进行探索。

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A review of methods for ageing mouse models

SUN KAI,JIANG Wei-wen
(Department of Oral Mucosal Diseases,Shanghai Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine·Shanghai Key Laboratory of Stomotology,Shanghai 200011,China)

The aging mouse models could be divided into two categories:natural aging models and artificial aging models. This paper reviewed the aging mouse models established by nature,D-galactose,β-amyloid protein injection,accelerated senescence,γ ray irradiation,ozone,thymectomy and transgene.The principles,methods,indicatorsofevaluation,advantages and disadvantages of each method were elaborated to provide reference for researches w ith different purposes,including the establishment of oral mucosal aging model

Ageing mouse model;indicator of evaluation;advantage and disadvantage

R787

A

1672-2973(2017)03-0181-04

2016-12-01)

国家自然科学基金资助课题(项目编号：81671036)上海市自然科学基金资助课题(项目编号：15ZR1424700)

孙 凯 上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜科·上海市口腔医学重点实验室 硕士 住院医师上海 200011

蒋伟文 通讯作者 上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜科·上海市口腔医学重点实验室 博士主任医师 副研究员 上海 200011