马铃薯松散型胚性愈伤组织的诱导

史滟滪++杨静慧++刘婷++梁发辉++刘艳军

摘 要：为了建立马铃薯松散型胚性愈伤组织体系，用于脱毒繁殖和诱变育种，试验采用马铃薯块茎为外植体，在含有不同浓度2，4-D，BA和MS的培养基上进行松软型、松散型和胚性愈伤组织的诱导。结果显示，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培养基上可以诱导出松软型马铃薯愈伤组织；在MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，继代3～5次，即可获得松散型愈伤组织；在MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，继代5～8次，即可获得松散型胚性愈伤组织。而且上述类型的愈伤组织生长迅速，结构特点突出。

关键词：激素；培养基；继代；脱毒培养

中图分类号：S532 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.005

马铃薯是一种在我国具有高产量、高效益的适合广大农作物地区耕作的粮食和经济作物。近年来，我国广大地区对马铃薯的栽培与育种方面的研究已取得了较多的突破，尤其是在马铃薯的组织培养方面取得了突出的成绩[1-4]。马铃薯的脱毒培养已经被广泛应用于马铃薯的种薯生产中，使用马铃薯脱毒种薯比没脱毒的一般可增产30%～50%[5-10]。

目前，马铃薯脱毒培养主要依赖于茎尖脱毒技术，而采用松散型胚性愈伤组织进行组织脱毒的报道极少。用松散型胚性愈伤组织进行脱毒培养的方法可以获得高效、优质的无毒材料。

本研究旨在采用这一脱毒新途径建立马铃薯无毒苗培养体系，为生产上获得优质无毒的马铃薯种源；本研究获得的松散型胚性愈伤组织还可以用于体细胞诱变育种研究，可为马铃薯的育种拓宽途径、奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究使用的马铃薯是购自天津市蔬菜市场的菜用马铃薯品种。

1.2 试验方法

松软型愈伤组织的培养方法：将马铃薯块茎外植体接种到1/2，1/4 MS培养基中，其中分别加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的2，4-D，在接种10 d后在外植体伤口部位开始长出愈伤组织，经过大约40 d培养选择生长迅速的、结构松软的愈伤组织进行下一步培养。

松散型愈伤组织的培养方法：将所获得的马铃薯松软型愈伤组织，转移到含有不同激素的松散型愈伤组织诱导培养基上，其中分别加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生长素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的细胞分裂素BA。经过3～5次继代培养后（每10 d继代一次），选择结构松散的、生长迅速的愈伤组织进行下一步培养。

松散型胚性愈伤组织的培养方法：将上述获得的松散型愈伤放入超净台中，再用解剖刀切成直径3 mm的小块，转移到松散型胚性愈伤组织诱导培养基上。其中含有0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生长素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1BA，或仅含有1.0，2.0 mg·L-1 BA及仅含有1.0 mg·L-1 2，4-D。经过5～8次继代培养后（每20 d继代一次），愈伤组织从外观上出现了较大的变化，其中一些愈伤组织表面出现瘤状颗粒，结构松散、质地紧密，在显微镜下可以看到愈伤组织细胞个体较小、细胞质浓度增大、细胞核较大，细胞处于旺盛的分裂状态，即为松散型胚性愈伤组织。

以上处理均为每个处理6个重复，每处理放置8块外植体，培养基均为MS培养基，添加7.0 g·L-1琼脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH值调到5.8。1/2 MS培养基为无机盐采用1/2，蔗糖15 g·L-1，琼脂粉7 g·L-1，pH值为5.8；1/4 MS培养基为无机盐采用1/4，其余同1/2 MS的用量。

2 结果与分析

2.1 生长素和MS倍数对马铃薯块茎松软型愈伤组织形成的影响

通过不同浓度的生长素和MS总浓度的改变，比较愈伤组织的诱导率和生长速度以及质地的变化，结果如表1所示。从表1可以看出，所有处理都能诱导出愈伤组织，说明马铃薯是一种容易诱导产生愈伤组织的植物，但从愈伤组织生长及质地情况来看，不同培养基差异较大。其中，MS的倍数对愈伤组织质地影响较大，当用1/4 MS培养基培养时，愈伤组织为软愈伤；而用1/2 MS培养基培养时，愈伤组织都为较硬的愈伤；不同2，4-D激素浓度也影响着愈伤组织的生长速度，在1/2 MS处理组中，增加2，4-D质量浓度0.25 ～2.0 mg·L-1时，愈伤组织生长速度会逐渐增加；但在1/4 MS处理组中，当其浓度超过1.0 mg·L-1时，愈伤组织生长速度出现下降。所以，在本试验中，当2，4-D的浓度为1.0 mg·L-1时，培养的愈伤组织是松软型愈伤组织，且生长速度较快。因此，马铃薯诱导松软型愈伤组织的最佳培养基配方为：1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖。

2.2 激素对马铃薯块茎松散型愈伤组织形成的影响

通过不同浓度的BA和2，4-D激素组合，比较愈伤组织的质地、颜色和生长速度以及结构的变化，结果如表2所示。从表2可以看出，在不同处理中，诱导出的愈伤组织多数为紧密型，其中，采用较低的2，4-D浓度培养时（0.25 mg·L-1），随着BA浓度的增加，愈伤组织的质地逐渐变硬，愈伤组织结构也从松软变得松散，但进而变得紧密，说明BA使用浓度不宜过大，否则会导致愈伤组织致密、硬化；当BA浓度为0.5 mg·L-1时，愈伤组织基本为松散型愈伤。在BA浓度不变时，增加2，4-D的用量，愈伤组织结构基本为紧密型，虽然愈伤组织质地从软变硬，但基本都是一些生长速度较快的细胞紧密结合在一起，造成愈伤组织团结构紧密。因此，适当选择2，4-D的浓度是获得松散型愈伤组织的关键。

本试验还发现，随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织生长速度加快，虽然愈伤组织生长速度对于愈伤组织诱导有利，但过快则不能获得理想的愈伤组织结构。综上原因，对于诱导马铃薯松散型愈伤组织最理想的培养基为：MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖。虽然培养基对于诱导马铃薯松散型愈伤组织十分必要，但继代次数与继代时间也很重要，在继代转移时将质地较硬的愈伤组织选择下来也非常重要。

2.3 激素对马铃薯松散型胚性愈伤组织形成的影响

通过不同浓度的BA和2，4-D激素组合，比较愈伤组织的胚性、生长速度及其结构的变化，结果如表3所示。从表3可以看出，只加入BA或2，4-D激素时愈伤组织不能胚性化，单独使用BA只能使得愈伤组织结构紧密，而单独使用2，4-D只能使愈伤组织结构为松散型；当使用BA或2，4-D激素浓度为1.0 mg·L-1时，生长速度较快，而当激素浓度为2.0 mg·L-1时，生长速度有所下降。当加入一定浓度的BA和2，4-D激素组合时，愈伤组织部分或全部胚性化，愈伤组织结构松散型，生长速度随激素浓度的增加而增加；但当2种激素组合的浓度达到2.0 mg·L-1时，愈伤组织结构变为紧密型，生长速度及胚性都有所降低。

3 讨 论

2，4-D在愈伤组织诱导过程中起决定性作用，其在一定浓度范围内，浓度的增加有利于胚性愈伤组织的诱导 [11-14]，但过高或过低的2， 4-D 浓度均不利于胚性愈伤组织的形成和分化再生 [15-18]。总的来看，诱导效果最好的是使用2，4-D或配合其他分裂素一起诱导，关于2，4-D的使用浓度主要根据植物的特性而定。另外，外植体的种类与生长势、培养温度、培养基的渗透压以及附加其他生长素等都会影响2，4-D的使用浓度。

松散型愈伤组织在继代培养时进行正确的选择是很关键的。在进行愈伤组织诱导过程中，除了要考虑培养基成分与培养条件，对不同愈伤组织的取舍也非常关键。在诱导初期选择较为坚硬的愈伤组织进行培养，然后对生长较快的愈伤组织进行继续培养，还应及早筛除一些质地很硬但并不松散的愈伤组织，否则会影响对松散型愈伤组织的正确选择。

影响愈伤组织胚性化的因素既有内因，也有外因。内因主要是遗传问题，不能改变，而外因则是可以选择的。因此，要想获得愈伤组织的胚性化就必须找到适合的培养条件，在这些因素中，激素是很重要的影响因子，分裂素对愈伤组织胚性化作用较大。此外，培养温度、营养、渗透压、湿度等逆境条件也会对愈伤组织胚性产生一定的影响。总之，在进行愈伤组织胚性化诱导中，正确选择培养条件是试验成功的关键。

4 结 论

通过对马铃薯松散型胚性愈伤组织诱导过程中试验，得到了一套完整的诱导方法：采用马铃薯块茎为外植体，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培养基上诱导出松软型愈伤组织；移入MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，继代3～5次，获得松散型愈伤组织；再移入MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培养基上，继代5～8次后，即可获得马铃薯松散型胚性愈伤组织。

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