分光光度法测定铜绿微囊藻细胞密度研究

周绪申，马帅领，尚志鸣，王 迎，郭丽峰，林 超

(1.海河流域水环境监测中心，天津 300170;2.北京空间机电研究所，北京 100191; 3.海河流域水资源保护局，天津 300170)

分光光度法测定铜绿微囊藻细胞密度研究

周绪申1，马帅领2，尚志鸣2，王 迎1，郭丽峰1，林 超3

(1.海河流域水环境监测中心，天津 300170;2.北京空间机电研究所，北京 100191; 3.海河流域水资源保护局，天津 300170)

本文通过测定纯种铜绿微囊藻的分光光度吸收曲线,分析其吸收峰值,并建立了不同藻细胞密度与吸收峰值的线性关系,从而提供一种快速、简单的铜绿微囊藻细胞密度分光光度测定方法。结果表明:铜绿微囊藻在440和680nm波长处各有一个较大的吸收峰,铜绿微囊藻不同藻细胞密度与2波长的光吸收值呈良好的线性关系,细胞密度与叶绿素a含量也呈较好的线性关系。

铜绿微囊藻;分光光度法;吸光特性;细胞密度

1 简介

蓝藻通常指蓝藻门(C y a no phy t a)的植物，又叫蓝绿藻，由于蓝藻中不含叶绿素 b、c，通过实验室培养的单细胞藻类对模型进行了实验分析验证，赵巧华［1］认为同一藻的标准化吸收光谱在不同生长时期基本恒定不变，色素组成及其比例的不同是引起藻类间吸收光谱变化的主要原因。深入了解藻类对光的吸收特性及对光的竞争能力，有助于了解水生生态系统的演变、浮游植物的种群组成、演替及蓝藻水华的形成机理。铜绿微囊藻(Mi c r o c y s i s ae r ugi no s a)属于蓝藻门球藻目微囊藻属，是一种全球广泛分布的淡水蓝藻，极易在富营养化淡水中形成水华，并且持续时间长，控制难度大、危害性大［2］，同时该藻不易被鱼类消化，严重破坏水生态环境。

水体富营养化中藻类监测指标主要包括生物量、藻密度和叶绿素a等［3］。其中叶绿素a是藻类重要的组成成分之一，其浓度的高低是表征光能自养生物量的重要指标。叶绿素a含量的高低与水体藻类的种类、数量等密切相关［4］。

有研究表明，通过测定水体中叶绿素a在一定程度上可以反映水体中藻类数量的多少和水质状况。叶绿素a与藻密度的变化都符合微生物生长的S型曲线，2者都可以表征水体生物量和水华预警的表征参数［5］。

通过实验室培养的纯种铜绿微囊藻，研究其光吸收光谱，以期得出适合于检测铜绿微囊藻细胞密度的简单可靠的分光光度方法，为今后室内藻类实验研究提供可靠数据资料和简便的计量方式，也为野外监测湖泊水体中的微囊藻水华的藻密度提供数据支持，并为更深入了解藻类对光的吸收特性及对光的竞争能力提供了重要理论依据。

2 实验方法

铜绿微囊藻(Mi c r o c y s t i s ae r ugi no s a)购于中国淡水藻种库，藻种扩大培养采用B G-11培养基，铜绿微囊藻培养采用人工气候箱(宁波赛福实验仪器厂)，培养条件设置为:光照度4000 l x，光暗周期12h∶12h，温度28℃，pH值为7.0。

铜绿微囊藻吸光值用光栅分光光度计(722型，上海第三分析仪器厂)测定，扫描波长的范围为300～900nm，扫描间隔为5nm。

细胞密度在光学显微镜(Z E I SS Sc o peA 1)下进行测定，采用浮游生物计数框(0.1m l，购于中科院水生生物研究所)计数，分别计1、3、5行共30个方格数值，通过所记数值与小格体积计算藻细胞密度。藻细胞对比采用藻类分类检测仪(B B E，F l uo r o P r o be)进行测定。

叶绿素a浓度采用经过0.45 μ m的纤维滤膜抽滤100m L，反复冻融-浸提，运用改进的丙酮萃取方法进行测定。

3 实验结果

3.1 铜绿微囊藻光吸收曲线

以扩大培养的铜绿微囊藻在分光光度计上做300～900nm之间的范围做扫描，以300nm为起始点每间隔5nm做一次扫描，作铜绿微囊藻的光吸收曲线，如图1所示。

图1 铜绿微囊藻光吸收曲线

由图1可知，铜绿微囊藻在440和680nm处分别有一个较大的吸收峰，这是由铜绿微囊藻含有叶绿素a所致，在620nm左右较宽的吸收峰，是铜绿微囊藻含有藻蓝蛋白的缘故［6］。

3.2 铜绿微囊藻稀释倍数与吸光值的关系

虽然铜绿微囊藻 440和 680nm处的峰值较大，但数值是否与藻密度有线性关系未知。故将密度为109个/L的铜绿微囊藻稀释成不同密度的藻液，做曲线比对440和680nm处的吸光值，如图2所示。

由图2可知，铜绿微囊藻在440和680nm的吸光值与稀释倍数成较好的线性关系，线性关系和回归系数分别为:y=0.8431x+0.034(440nm)，R2=0.9973;y=0.7886x+0.0293(680nm)，R2=0.9945。

3.3 铜绿微囊藻吸光度与藻密度的关系

由于稀释倍数直接与细胞密度成反比的线性关系，而稀释倍数与440和680nm的吸光值线性关系都较好，因此440和680nm的吸光值可作为铜绿微囊藻细胞密度的反映。为探讨其计算的关系式，将不同密度铜绿微囊藻分别做440和680nm的吸光值曲线，如图3所示。

图2 铜绿微囊藻稀释倍数的倒数与吸光值的曲线(上440n m，下680n m)

图3 铜绿微囊藻吸光度与藻密度的关系(上440n m，下680n m)

铜绿微囊藻密度与440和680nm的吸光值线性关系均较好，其线性方程和回归系数分别为:y= 773.93x-3.5049(440nm)，R2=1和y=893.94x-8.2264(680nm)，R2=0.9994。

3.4 铜绿微囊藻叶绿素a浓度与藻密度的关系

铜绿微囊藻的藻密度与其叶绿素 a浓度关系未知，虽以前诸多研究涉及，但多为研究水体中的藻类(藻类多样)，或者研究结果非常不一致。为取得纯种铜绿微囊藻的藻密度与叶绿素a之间的关系式，本次实验取不同密度的铜绿微囊藻分别测定其叶绿素a的值，做曲线如图4所示。

X 832

A

1008-1305(2016)05-0050-02

10.3969/j.issn.1008-1305.2016.05.019

2016-02-04

国家国际科技合作专项资助(2013D F A 71340)，国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012Z X 07203-002)，水利部科技推广项目(T G 1408))，水利部技术引进项目(201412)

周绪申(1982年—)，男，工程师。