胰腺癌患者尿液的代谢组学初步研究

田舍 江建新 张浩 张宏 刘兴贵

(贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004)

·技术与方法·

胰腺癌患者尿液的代谢组学初步研究

田舍 江建新 张浩 张宏 刘兴贵△

(贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004)

胰腺癌；尿液； 代谢组学; 质子核磁共振; 非损伤性诊断; 生物标记物

胰腺肿瘤(pancreatic cancer ,PC)为消化道发病率较高的恶性肿瘤，相较于其它类型肿瘤来说预后较差，是世界范围内致死率排名第七的肿瘤[1]。尽管医学技术取得了巨大的进步，但是对于胰腺癌的早期诊断和治疗一直束手无策，胰腺癌患者的5年生存率仍然低于6%。2013年美国的调查报告中显示46 420例(23 530例男性和22 890例女性)检查出患有PC, 39 590例(20 170例男性和19 420例女性)死亡[2]。世界范围内，在2012年约有338 000例检查出患有胰腺癌[3]。由于胰腺在人体的位置较深，缺乏早期的检查手段，且胰腺肿瘤恶性程度较高，一般的治疗效果不理想，这些都是造成不良预后及生存期较短的主要原因[4-6]。由于影像学检查和血清肿瘤标记物测定等非损伤性的诊断方法缺乏敏感性和特异性，病理组织检查成为目前唯一可靠的诊断肿瘤类型及肿瘤分期的方法。但是病理活检并不太适合胰腺癌高危人群早期的筛查及诊断,因此运用质子核磁共振(1HNMR)这种非损伤性的检测方法[6]来进一步探索PC患者体内代谢物质的改变，寻找能有效应用于临床胰腺癌早期诊断和筛查的检测方法就显得很有必要。

1 材料与方法

1.1 一般资料 病例来源于贵州医科大学附属医院2012年1月至2013年12月通过影像及术后病理诊断已确诊的胰腺癌患者14例作为肿瘤组，其中男性6例，女性8例；平均年龄(60.0±8.00)岁。所有患者在收集尿液之前未使用任何药物及治疗干预，取尿液储存于-80 ℃冰箱内保存。11名正常健康人作为对照组，其中男性5名，女性6名；平均年龄(33.3±9.41)岁；尿液标本取自健康体检者。入选者无免疫性疾病、肿瘤性疾病，近期无感染。肿瘤组与健康对照组之间在年龄、性别等方面具可比性(P>0.05)。

1.2 尿液样品核磁共振分析 500 μL重水与50 μL 3-三甲基甲硅烷基-2, 2, 3, 3-四氘代丙酸钠[3-trimethylsilyl-(2,2,3,3-2H4)-propionate, TSP]混匀后高速低温离心，将100 μL样品上清加入直径5 mm的NMR玻璃样品管。在Bruker DPX-600.13 MHz核磁共振仪上记录尿液水相质子核磁共振谱。以TSP作为尿液样品1HNMR谱化学位移的参照峰，设为0 ppm (δ0.0)。

1.3 NMR数据处理以及模式识别分析 利用Principle Component Analysis (PCA)进行分析。基于PC的得分图(score plot)区分不同处理组别；基于PC的输出载荷图(loading plot)可判定95%的可信区间内的代谢物。

1.4 化学位移指认 将有差异的化学位移通过Human Metabolome Database (HDMB)查询[7]。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件，对计量资料进行比较，符合正态分布的采用Student'st检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

通过主成分分析法(PLS)分析尿液代谢小分子产物，用以区分两组人群。在尿液1HNMR谱的得分图中，胰腺肿瘤患者组与正常对照组能明显的区分开。

PCA线图分析获得的VIP线图(图1)将胰腺癌患者与健康人群对照组尿液代谢物区含量高低分开，根据输出线图判定具有含量变化的区间，通过对区间的变化，找出具有差异的代谢产物。表见1。

表1 胰腺肿瘤患者与正常人群相比较代谢物质的变化

图1 胰腺癌患者与健康人尿液代谢物线图

3 讨 论

胰腺因为受肿瘤细胞生长的影响而引起内外分泌功能的异常，出现人体能量、脂肪及氨基酸代谢状态的改变，同时机体为适应肿瘤组织引起的代谢异常而又出现一定的代偿，最终体现在机体组织、血液及尿液代谢组学成分上的改变。

胰腺肿瘤患者从尿液代谢组差异结果来看，主要出现机体糖代谢紊乱和脂肪酸的氧化能力降低，同时伴随代谢分解状态亢进、有氧呼吸和线粒体功能异常[8]及线粒体酶的损伤等，使得有氧氧化途径“原料”堆积在血液中，造成物质代谢的异常。在我们的实验研究中，β-葡萄糖、丙酮、硒代胱氨酸和乙酸盐等含量明显高于对照组，进一步说明胰腺肿瘤患者尿液中物质代谢与健康人存在明显差异，发现这些异常增多的代谢物质，有助于今后进一步筛查出更特异的早期诊断胰腺肿瘤的代谢组学方法打下一定的研究基础。

此外，可能因为局部生长的关系，特别是胰腺这种调整机体各种功能的重要器官因肿瘤细胞影响而导致机体内一些氨基酸代谢相关的酶发生代谢状态改变而造成氨基酸的异常积聚。同时我们发现也有一些调控肿瘤细胞凋亡基因的氨基酸含量明显增加，如谷氨酰胺/谷胱甘肽、1,3-丙二胺等，作为天然的抗氧化物中和细胞内氧自由基，在肿瘤的初始阶段和发展过程中有着重要的作用，这可能与谷胱甘肽调控Jun N-terminal kinase (JNK)信号通路调控细胞的凋亡有关[9-10]。

近年来的研究表明，不同肿瘤的制备样品的代谢图谱与肿瘤的类型、增殖、代谢活性剂细胞凋亡具有相关性。通过对肿瘤代谢图谱的研究，有助于人们了解肿瘤发生、发展以及致死的机制[11]，同时在临床中可以作为非侵入性检查手段，是临床工作检查策略的补充。我们的研究中也同样存在一些不足，如所有患者均来自本省，病例数过少等。总之，HNMR代谢物的筛查，为临床诊断工作提供一条有效的非侵入性的早期诊断胰腺肿瘤的方法。

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贵州省卫计委科学技术基金项目[gzwkj 2010-1-037]

R735.9

B

1000-744X(2016)02-0196-02

2015-05-21)

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