荧光成像技术在组织热损伤评价中的应用

汤陌生

丽水市人民医院 医学工程部，浙江丽水 323000

荧光成像技术在组织热损伤评价中的应用

汤陌生

丽水市人民医院 医学工程部，浙江丽水 323000

目前组织热损伤主要依靠离体切片组织学进行评价，尚没有一种较理想的评价方法。本研究设计了一种利用340 nm波长的自体荧光成像技术评估活体组织热损伤的方法，并采用该方法对激光照射后的牛腱组织进行了荧光成像，将荧光成像后的牛腱组织样本与日光灯下成像后的牛腱组织样本通过天狼星红F3BA染色的组织学方法进行了验证和比较。实验结果显示，样本中受激光照射区域的胶原蛋白的自体荧光发生了明显改变，说明该方法能够用于评价组织热损伤。

荧光成像技术；组织热损伤；胶原蛋白

激光能够对目标区域进行加热，其原理是利用生物组织对光子的吸收特性，将光子能量转变为热量，使被照射组织温度升高，导致组织中蛋白质脱水、变性、凝固或者消融[1]。目前，激光技术在医学领域得到了越来越广泛的应用，例如激光凝固[2]、激光血管清理重通[3]、激光组织焊接[4]等，其治疗效果取决于向目标组织发送的激光能量和目标组织的特性，但激光治疗也会导致组织热损伤，而针对组织热损伤的评价还停留在纯经验或半经验状态[5]。激光组织热损伤评价涉及物理、生物、医学等多学科知识，目前还没有一个公认的数学评价模型[6]。为了在激光治疗过程中更好地保护正常组织，需要开发一种快速、可靠的活体组织热损伤评价方法。

自体荧光技术可分辨组织中的分子改变[7]，广泛应用于生物组织改变的检测[8]。针对自体荧光技术诊断肿瘤的相关研究表明，肿瘤组织的自体荧光改变多与组织中胶原蛋白的改变有关[9-11]。胶原蛋白在受热后会发生变性，变性的胶原蛋白自体荧光光谱和荧光图像会发生相应的变化[12]。而生物组织中存在着丰富的胶原蛋白，尤其是皮肤、肌腱、角膜等组织中的胶原蛋白含量更高[13-14]。因此，通过观察热损伤组织中胶原蛋白的自体荧光强度的改变，或可以对组织热损伤进行评价。因此，本研究利用热损伤组织中胶原蛋白自体荧光特性的改变，设计了一种使用自体荧光技术诊断活体组织热损伤的方法，报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

热损伤组织自体荧光成像装置示意图，见图1(a)。其中，氙灯（300 W）为光源，光束通过340 nm的窄带滤光片（半宽度为5 nm）。样本与镜头平行，以避免不规则的折射对自体荧光图像产生影响，经多功能光学测量计测量，到达样本表面的光束能量为35 μW/cm2。在镜头1（105 mm UVNIKKOR镜头）前有一个380 nm的窄带滤光片（半宽度为5 nm）。荧光经图像增强器放大以后，由镜头2进行成像，最终由相机（TM-72EX，PULNIXAmerica Inc., Sunnyvale CA）采集荧光图像并将其传输给电脑。图像采集系统每秒可采集3幅图像，为提高图像质量，每幅荧光图像为10帧图像叠加所得。日光灯照射成像装置示意图，见图1(b)。在相同条件下拍摄与荧光图像同一位置的组织图片。

图1 实验装置示意图

1.2 实验方法

1.2.1 激发光和自体荧光波长的选择

选取胶原蛋白粉作为本实验的参考对象，胶原蛋白在325～355 nm光源激发下会产生荧光[15]。将胶原蛋白粉放在石英槽内，采集300～380 nm波长光激发下的胶原蛋白粉荧光光谱。根据胶原蛋白粉在不同波长激发光下的荧光光谱，本实验选择340 nm波长光作为激发光源，采集380 nm波长的荧光图像。

1.2.2 热损伤组织的自体荧光成像

（1）选择含有丰富胶原蛋白的牛腱子肉作为实验对象。将牛腱子肉切成厚度为5 mm的均匀薄片样本，每6个样本分为一组。

（2）然后采用氩气激光诱导组织热损伤，激光造成的热损伤直径约1 mm。激光到达样本表面的功率密度为274 W/cm2，对样本进行垂直照射，照射时间分别为3、6、9、12、15 s。

（3）将激光处理后的样本放在石英载片上，进行荧光成像和日光灯下成像，并测量样本组织表面热损伤的直径，测量结果采用均值加减标准差（±s）表示（表1）。完成测量后，将样本在-20 ℃条件放置15 min，冻结后切割，在常温下对样本的横截面进行荧光成像和日光灯下成像，并测量样本的热损伤垂直深度，测量结果采用均值加减标准差（±s）表示（表1）。

表1 不同照射时间下组织热损伤深度（mm）

1.2.3 染色

在完成荧光分析和荧光成像后，对样本进行脱水、石蜡处理，制成厚度为5 μm的切片。对切片采用天狼星红F3BA进行染色，然后在偏振光显微镜下成像[16-17]。

2 结果

通过激光照射后的牛腱组织荧光图像，见图2～3。可以看出，由于组织中的胶原蛋白受激光照射变性，导致自体荧光图像中热损伤组织的荧光强度明显变弱。荧光图像中正常组织和热损伤组织之间的界限清晰，与日光灯下的样本图像对比，能更容易的分辨正常组织和热损伤组织。

图2 激光照射后牛腱组织表面图像

图3 激光照射后牛腱组织横截面图像

通过测量样本在不同照射时间下的自体荧光图像和日光灯下的图像中热损伤部分的表面直径（表1），可以看出当激光照射时间为3 s的时候，荧光图像和日光灯下的图像测量结果偏差较大。

对天狼星红F3BA染色的同一样本横断面的组织学切片分别在日光灯下成像和在偏振光下成像，发现激光照射后样本组织结构消失，但正常组织和热损伤组织的界限不明显。偏振光下的图像，见图4，正常组织胶原纤维呈现黄色或橙色，受激光照射的组织则没有这种双折射光。分别测量同一样本的自体荧光图像、日光灯下的图像和天狼星红F3BA染色的偏振光照射图像中的热损伤深度（表1），发现偏振光照射下的图像的测量结果和自体荧光图像测量的结果基本一致。激光照射时间为3 s的样本组测量数据显示中，日光灯下成像和自体荧光成像所测得的热损伤深度偏差较大。

图4 F3BA染色切片图

3 讨论

查阅资料可知，胶原蛋白大约在65 ℃左右变性[18]，因此可以从组织学的角度评价组织热损伤程度。在组织的自体荧光图像中，激光照射区域的荧光强度明显减弱。根据这一特性，笔者认为自体荧光成像技术可以作为一种定量技术来评价组织中胶原蛋白的改变。

本组研究中，表1中的数据证明了荧光图像测得的结果和天狼星红染色测定法的结果很接近，说明通过荧光成像检测组织热损伤比较可靠。通过图2～4可以看出，在激光热损伤组织中，最强大的热损伤不是发生在样本表面，而是发生在样本的中心，这与文献中的描述结果一致[19]。

日光灯下的图像相当于肉眼看到的结果，从图2～3可以看出，用肉眼来评价组织热损伤不可靠、不精确。特别是在热损伤不是很严重的情况下，通过肉眼辨别组织的激光热损伤十分困难。

本研究结果表明，自体荧光成像技术可作为评价富含胶原蛋白的活体组织热损伤的方法。这一技术能够在激光治疗过程中对治疗效果做出有效、快速的评价，以避免正常组织受到不必要的损伤。

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Application of Fluorescence Imaging in the Evaluation of Thermal Damage to Tissue

TANG Mo-sheng
Department of Medical Engineering, People’s Hospital of Lishui City, Lishui Zhejiang 323000, China

Currently thermal tissue damage is mainly evaluated with histological examination which requires the removal of a section of tissue.There is no ideal method to detect molecular changes after thermal damage tissue. The research designed a new method to evaluate thermal tissue damagein situusing native fluorescence spectroscopic imaging under 340 nm excitation. Native fluorescence spectroscopic imaging was performed on laser irradiated bovine tendon tissue. The fluorescence imaging of the tendon tissue were confirmed and compared with the image of the laser-irradiated tendon tissue with the histological method of picrosirius red F3BA stain. The results of the experiment indicate that the changes in native fluorescence from collagen on the laser-irradiated tissue could be observed on the thermal damage region of the tissue.

fluorescence imaging; tissue thermal damage; collagen

R445.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.03.011

1674-1633(2016)03-0053-03

2015-11-04

2015-11-27

作者邮箱：tangmosheng@126.com