五种金花茶组植物的耐寒性比较研究

李吉涛， 谢伟玲， 柴胜丰， 唐健民， 韦 霄

( 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所, 广西 桂林 541006 )

五种金花茶组植物的耐寒性比较研究

李吉涛， 谢伟玲， 柴胜丰， 唐健民， 韦 霄*

( 广西壮族自治区中国科学院 广西植物研究所, 广西 桂林 541006 )

金花茶组植物是世界珍稀、濒危的观赏植物，具有极高的观赏价值和药用价值。为了比较金花茶组植物的耐寒性, 以五种金花茶组植物为材料，采用人工模拟低温环境的方法对其2年生叶片进行低温胁迫处理，应用电导法研究五种金花茶种质在20 ℃(常温对照)、 8 ℃、-2 ℃、-7 ℃、-12 ℃、-17 ℃、-22 ℃和-27 ℃低温下相对电导率的变化，配合Logistic方程，测定其低温半致死温度(LT50)，以及叶片中游离脯氨酸、可溶性糖和丙二醛的含量。结果表明：五种金花茶的低温半致死温度(LT50)范围为-14.58～-12.74 ℃，其中金花茶为-14.58 ℃、龙州金花茶为-14.27 ℃、柠檬黄金花茶为-13.44 ℃、直脉金花茶为-13.09 ℃、东兴金花茶-12.74 ℃。低温半致死温度能反映金花茶种质的耐寒性，金花茶和龙州金花茶耐寒性强，其次为柠檬黄金花茶和直脉金花茶，东兴金花茶耐寒性较弱。在降温过程中，五种金花茶叶片相对电导率随温度降低呈S型上升，与温度呈负相关；脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量均呈现先上升后下降的趋势。同一低温条件下，半致死温度低的金花茶脯氨酸和可溶性糖的含量更高，而丙二醛含量更低。该研究结果为金花茶组植物耐寒种质选育提供了科学依据，为人工种植金花茶提供了技术支持。

金花茶组， 相对电导率， 半致死温度， 耐寒性

金花茶组植物为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，是世界珍稀的观赏植物与种质资源，是山茶花中唯一具有金黄色花的类群，被誉为“世界珍品、茶族皇后”，亦是培育黄色系山茶新品种的珍贵材料，具有极高的观赏价值和科研价值。其中金花茶已列入国家一级保护植物和国际生物多样性公约附属II物种(傅立国，1992；梁盛业，1993)。目前，对于金花茶组植物逆境生理，研究发现干旱胁迫影响金花茶幼苗光合生理特性、抗氧化能力及渗透物质含量(柴胜丰等，2015；邓旭等，2012)。李辛雷等(2006)的研究表明，显脉金花茶、金花茶、贵州金花茶、长柱金花茶和直脉金花茶等5个物种属于中度热敏感性物种。赵世伟(1995)进行了金花茶组植物的引种北移试验，探讨了金花茶组植物对低温胁迫的反应及抗寒性鉴定。吴洪明(2004)通过电导法测定从金花茶(C.nitidissima)中选育的品种(‘金农推’‘金防城’‘金坛洛’‘金皇后’)、小花金花茶(C.micrantha)和从弄岗金花茶(C.grandis)中选出的‘金陇瑞’低温条件下叶片的电解质渗出率并初步分析了叶片受冻临界低温范围。大部分金花茶组植物的花期比较长，一般是11月至翌年3月，期间恰逢“春节黄金周”。花期若遭遇“倒春寒”等低温天气，势必影响其观赏价值。因此，开展金花茶抗寒种质资源评价，对其抗寒性进行评价，探讨其抗寒胁迫生理，筛选出耐寒性强的金花茶种质，对于保护金花茶种质资源、扩大其引种范围、促进产业发展均具有重要意义。

遭受低温胁迫后，植物细胞膜的透性增加，胞内电解质外渗，致使电导率增大。电导率大小与细胞受伤害程度呈正相关。电导率越高，说明植物细胞膜受到的伤害越大，植株的抗寒性越弱(Lyons & Raison，1970)。电解质渗出率法是植物抗寒性鉴定中常用且比较可靠的一种方法(Liu et al，2012)，其结果与物种的田间冷害症状等基本相符，常被用来作为植物抗寒性鉴定的理化指标(李刚等，2007；许瑛和陈发棣，2008；王冠群等，2014；王玮等，2015；赵昌琼等，2003)。茶梅、佛手、锦带花、苹果、葡萄等园艺植物的耐寒性评价均采用电解质外渗法(徐康等，2005；郭卫东等，2009；王玲等，2012；时朝等，2013；何伟等，2014)。本研究以五种金花茶种质为实验材料，测定人工模拟低温胁迫下的相对电导率和相关生理指标，分析其耐寒性差异，以期为金花茶组植物耐寒种质的选育提供实验依据，为热带起源的金花茶组植物的北移、防寒栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及低温处理

金花茶组植物种类为金花茶(Camellianitidissima)、龙州金花茶(C.longzhouensis)、柠檬黄金花茶(C.limonia)、直脉金花茶(C.multipetala)和东兴金花茶(C.tunghinensis)，选取生长势基本一致的健康植株的两年生枝条的中部叶片，采摘后立即装入自封袋，速带回实验室。分别用自来水、蒸馏水冲洗，用吸水纸吸干水分。将每种叶片分成8份，置于密封的自封袋中，放入低温培养箱中进行低温处理。根据金花茶种质圃所在地桂林雁山的年均温度(约20 ℃)、绝对低温(-6 ℃)及油茶、山茶的低温半致死温度(王永红等，2006；韦霄等，2007；曾雯君等，2013)，试验设置7个处理温度，分别为8 ℃、-2 ℃、-7 ℃、-12 ℃、-17 ℃、-22 ℃和-27 ℃，以室温(20 ℃)为对照。参考王冠群等(2014)的低温处理程序并做适当调整，当低温培养箱为8 ℃时，将材料放入缓慢降温，降温速度为10 ℃·h-1，降至目标温度后维持3 h。材料取出后，分析测定电解质渗出率，并进行脯氨酸、可溶性糖、丙二醛等生理指标分析及鉴定。实验重复3次。

1.2 叶片电解质渗出率的测定

将对照和处理组叶片拿出后，避开主脉和边缘，将叶片剪碎，准确称量1.0 g放入试管中，加入20 mL去离子水，室温震荡浸提6 h后静置待测。先用DDS-11A型电导仪测定浸提液的电导率R1，代表低温处理后的叶片电解质的外渗值。再将盛有浸提液的试管置于灭菌锅中，121 ℃处理10 min，冷却后静置6 h，测定所有细胞被破坏后浸提液的电导率R2，代表细胞电解质的总含量。最后用去离子水的电导率RCK作为对照，计算相对电导率(REC)= [(R1-RCK) /(R2-RCK)] × 100%。将电解质渗出率配以Logistic回归方程y=K/(1+ae-bx)求得拐点温度即半致死温度(LT50)。式中，y为相对电导率，x为处理温度，a、b是方程参数，K是相对电导率饱和值。计算方法参照莫惠栋 (1983)和刘世红等(2011)的方法。

1.3 抗寒生理指标的测定

游离脯氨酸(Pro)、可溶性糖及丙二醛(MDA)含量测定参考李合生(2000)的方法，每个指标平行测定3次。

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，用LSD法检验不同处理间是否具有显著性差异，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 低温对叶片细胞相对电导率的影响

从图1可以看出，在经一系列低温处理后，五种金花茶种质叶片的相对电导率总体变化趋势均随处理温度的降低而逐渐升高，近似呈S型的单峰曲线分布。在降温初期(8～-12 ℃)，5种叶片的相对电导率均表现出不同程度的升高，说明叶片细胞膜损伤加重，膜透性增加，但同一温度不同金花茶叶片的REC差异不显著，其原因是植物可能在一定程度上对低温胁迫产生了防御反应，使细胞膜得以修复，说明适时的低温锻炼能够增强金花茶的抗寒性。随着处理温度降至-12～-17 ℃区间，相对电导率都超过了50%，说明此时离子渗透已经相当严重。当温度继续下降至-22～-27 ℃区间，相对电导率变化又趋平缓，说明此时细胞膜已基本被破坏，电解质大都渗透到细胞外。

2.2 金花茶低温半致死温度比较

相对电导率用Logistic方程进行拟合后，R2在0.97以上，说明拟合结果是十分可靠的。从表1可以看出，通过非线性回归分析并结合Logistic方程拟合，得到的拐点温度即为各金花茶种质的低温半致死温度LT50。五种金花茶种质的低温半致死温度分别为-14.58 ℃、-14.27 ℃、-13.44 ℃、-13.09℃和-12.74 ℃，分布范围为-12.74～-14.58 ℃，均出现在其各自相对电导率骤升的温度区域(-12～-17 ℃)内。根据低温半致死温度的高低，得出五种金花茶种质耐寒性由强到弱依次为金花茶 > 龙州金花茶 > 柠檬黄金花茶 > 直脉金花茶 > 东兴金花茶。

2.3 低温处理后五种金花茶叶片生理指标的变化

五种金花茶叶片的游离脯氨酸含量变化差异较大，但总体呈现先上升后下降的趋势，达到峰值的温度是-17 ℃，含量分别为79.71、78.33、74.04、73.90、70.41 ng·g-1FW；20 ℃和8 ℃时，不同金花茶叶片的脯氨酸含量发生变化，但是没有达到显著差异；当处理温度降到0 ℃以下，同一温度下不同金花茶叶片的脯氨酸含量变化差异显著(表2)，LT50低的金花茶脯氨酸含量高于LT50高的金花茶。

在低温胁迫下，随着处理温度的下降，五种金花茶的可溶性糖含量均呈现先升后降的变化趋势，LT50低的金花茶叶片的可溶性糖的含量更高。当温度降到-17 ℃时，5种材料的可溶性糖含量均达到峰值，半致死温度最低的金花茶可溶性糖含量为35.62 mg·g-1FW，半致死温度最高的东兴金花茶可溶性糖含量为28.99 mg·g-1FW。

在低温胁迫范围内，五种金花茶叶片的MDA含量随温度的降低呈现出先上升后下降的趋势，达到峰值的温度均为-17 ℃，但不同材料其MDA峰值含量不同，分别为58.02、59.10、73.24、74.00、82.61 nmol·g-1FW，LT50越低，MDA峰值越小(表2)。由此可知，低温胁迫后，膜脂过氧化程度与LT50高低正相关，LT50低的材料膜脂过氧化程度较低。

3 讨论与结论

低温是热带、亚热带植物生长过程中遭遇的主要非生物限制因子之一(邓仁菊等，2014)。本研究中，五种金花茶种质叶片经一系列低温处理后相对电导率总体变化趋势均随处理温度的降低而逐渐升高，近似呈S型的单峰曲线分布，这与朱根海等(1986)的研究结果一致。植物的抗寒能力的强弱并非单一因素所决定的，而是一个复杂的生理生化过程(Levitt et al, 1980)。经过低温锻炼，许多植物的抗寒能力明显增强，但抗寒力的增强幅度因植物种类而异。半致死温度(LT50)是评价植物抗寒性强弱的一个重要且比较准确的指标(刘慧民等，2014)。本研究从金花茶LT50入手, 并结合生理生化指标比较金花茶种质的耐寒性，方法简便且准确性较高，可以作为耐寒金花茶种质筛选的一个量化指标；而低温半致死温度(LT50)也可作为金花茶低温抗寒分子生物学研究的处理温度。通过对收集的金花茶组植物资源进行耐寒性评价，筛选出适合向亚热带季风气候区北缘推广种植的优良种质， 扩大引种范围，有利于更好地保护金花茶组植物种质资源。

图 1 五种金花茶相对电导率随温度变化的Logistic曲线 A. 金花茶; B. 龙州金花茶; C. 柠檬黄金花茶; D. 直脉金花茶; E. 东兴金花茶。Fig. 1 Logistic curve of relative electric conductivity to temperature of five species of Camellia sect. Chrysantha A. C. nitidissima; B. C. longzhouensis; C. C. limonia; D. C. multipetala; E. C. tunghinensis.

种名Species回归方程Regressionequation半致死温度Semi⁃lethaltemperature(℃)拟合度Fittingdegree金花茶CamellianitidissimaY=134．7943/(1+11．94235164e0．134x)-14．580．9837龙州金花茶C．longzhouensisY=129．1215/(1+11．84686804e0．141x)-14．270．9847柠檬黄金花茶C．limoniaY=122．1326/(1+10．93898833e0．151x)-13．440．9744直脉金花茶C．multipetalaY=103．7302/(1+28．52976512e0．25x)-13．090．9729东兴金花茶C．tunghinensisY=112．8015/(1+12．1255923e0．178x)-12．740．9756

注： X表示所对应的温度 (℃)，Y表示相对电导率 (%)。

Note: X and Y indicate temperature (℃) and relative electric conductivity (REC, %), respectively.

表 2 不同低温处理下五种金花茶叶片游离脯氨酸、可溶性糖及MDA含量的变化

注： 同列数据后标注的不同小写字母，表示在5%水平上不同种金花茶在同一温度下差异显著。

Note: The lower case after the figure in the same column indicate the same temperatures under different species had significant difference at 5% level.

脯氨酸与可溶性糖是植物细胞内两种重要的渗透调节物质。当遇到逆境胁迫时，植物体内脯氨酸与可溶性糖的积累可以降低细胞渗透势和保持细胞膜的稳定性，从而减轻低温胁迫对细胞的伤害(王忠, 2000；Mo et al, 2011)。本研究中，受低温胁迫后，五种金花茶叶片的脯氨酸与可溶性糖含量随着处理温度的降低呈先上升后下降的趋势。可能是由于细胞在低温胁迫初期失水，同时胞内的可溶性糖和游离脯氨酸的积累，促使细胞液的浓度增加和渗透势降低，从而保持细胞质膜的稳定性。但当温度继续下降到一定程度，细胞内的抗氧化系统遭到破坏，保护性酶活性丧失，导致可溶性糖和游离脯氨酸的合成减少，含量下降。但是在相同的胁迫温度条件下，LT50低、耐寒性强的金花茶种质合成渗透调节物质的能力可能更强，积累较多的可溶性糖和游离脯氨酸，更有利于减轻低温胁迫对植株的伤害。

MDA是膜脂过氧化的产物，可与细胞膜蛋白等结合，破坏细胞膜的稳定性；还会造成细胞膜内不饱和脂肪酸的过氧化，导致细胞膜破裂(庞金安等，2000)。MDA含量的变化可以反映低温胁迫后植物细胞膜的过氧化程度。当MDA大量增加时，表明植物细胞膜受到的破坏较严重(王树刚等，2011)。本研究中，金花茶叶片内MDA含量随胁迫温度降低而呈先上升后下降的趋势，与岳海等(2010)在热带起源的经济植物澳洲坚果中的研究结果一致。随着胁迫温度的降低，叶片中MDA含量逐渐升高，表明细胞膜脂发生了过氧化；当温度继续降低，MDA含量大幅上升达到峰值，膜脂过氧化加剧，叶片细胞受到严重伤害；之后MDA含量下降，但下降幅度不大，可能是可溶性糖、游离脯氨酸等渗透调节物质降低了细胞膜脂不饱和脂肪酸的过氧化程度，减缓了MDA的合成，对叶片细胞的保护作用增强(王冠群等，2014)。

本研究结果表明，金花茶和龙州金花茶耐寒性最强，柠檬黄金花茶和直脉金花茶的耐寒性次之，东兴金花茶的耐寒性最差。本研究是在模拟低温条件下进行金花茶种质耐寒性比较，但在实际生产中遭遇低温胁迫时可能还会伴随水分等胁迫，其生理变化会更复杂，相关研究仍需进一步深入。

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Cold tolerance of five species of Camellia sect. Chrysantha

LI Ji-Tao, XIE Wei-Ling, CHAI Sheng-Feng, TANG Jian-Min, WEI Xiao*

( Guangxi Institute of Botany, Guangxi Zhuang Autonomous Region and the Chinese Academy of Sciences, Guilin 541006, Guangxi, China )

Camelliasect.Chrysanthaare world-famous economic and ornamental plants with high ornamental and medicinal values. In order to determine the cold tolerance, to lay a theoretical foundation for cold tolerance breeding and to provide a technical support for artificial cultivation ofCamelliasect.Chrysantha, two-year old leaves of five species were employed as materials and treated under artificially simulated low temperature environment, includingC.nitidissima,C.longzhouensis,C.limonia,C.multipetalaandC.tunghinensis. We obtained the changes of electrolyte leakage rates (REC) at 20 ℃ (normal temperature control), 8 ℃, -2 ℃, -7 ℃, -12 ℃, -17 ℃, -22 ℃ and -27 ℃ by using conductance method，calculated the semi-lethal low temperatures (LT50) based on the changes in electrolyte leakage rates (REC) under different low temperature stresses with the Logistic equation, and also analyzed the contents of free proline, soluble sugar and malondialdehyde (MDA) in leaves. The results showed that the semi-lethal temperature (LT50) of five species was:C.nitidissima-14.58 ℃,C.longzhouensis-14.27 ℃,C.limonia-13.44 ℃,C.multipetala-13.09 ℃, andC.tunghinensis-12.74 ℃. The cold tolerance of five speciesCamelliasect.Chrysanthacould be reliably reflected by the semi-lethal temperature.C.nitidissimaandC.longzhouensishad high cold tolerance.C.limoniaandC.multipetalahad medium cold tolerance.C.tunghinensishad poor cold tolerance. The REC of the five species increased following an S-curve with the temperature drop, and temperature showed highly significant negative correlation to cold tolerance. The contents of free proline, soluble protein and MDA increased first and then decreased. Under the same temperature treatment,C.nitidissimawith lower LT50temperature had higher contents of free proline, soluble protein and lower contents of MDA. The results provide the information for selection of cold-tolerant germplasm ofCamelliasect.Chrysantha.

Camelliasect.Chrysantha, relative electric conductivity, semi-lethal temperature, cold tolerance

10.11931/guihaia.gxzw201511023

2015-11-19

2016-02-15

国家自然科学基金(31160137)；广西自然科学基金(2015GXNSFBA139051, 2016GXNSFAA380122)；广西植物研究所基本业务费项目(桂植业14004) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31160137); the Natural Science Foundation of Guangxi (2015GXNSFBA139051, 2016GXNSFAA380122); the Science Research Foundation of Guangxi Institute of Botany (Guizhiye 14004)]。

李吉涛(1980-)，男，博士，助理研究员，主要从事植物分子生物学研究，(E-mail)ljtyouth@163.com。

*通讯作者： 韦霄，博士，研究员，主要从事生物多样性保育研究，(E-mail)weixiao@gxib.cn。

Q945.78

A

1000-3142(2016)12-1403-07

李吉涛， 谢伟玲， 柴胜丰，等. 五种金花茶组植物的耐寒性比较研究 [J]. 广西植物，2016，36(12):1403-1409

LI JT, XIE WL, CHAI SF，et al. Cold tolerance of five species ofCamelliasect.Chrysantha[J]. Guihaia，2016，36(12):1403-1409