荧光定量16SrRNA基因检测诊断妇产科菌血症的应用价值

任明保,李 扬,赵金辉,刘 晶

荧光定量16SrRNA基因检测诊断妇产科菌血症的应用价值

任明保1,李 扬1,赵金辉2,刘 晶2

目的 评价荧光定量16SrRNA基因检测诊断妇产科患者菌血症的应用价值。方法 2013-01至2014-12对100例疑为全身感染处于菌血症状态的住院分娩孕产妇进行常规血液培养，同时行细菌16SrRNA基因检测，包括DNA提取、设计引物和探针、PCR扩增及对扩增产物荧光定量检测，以临床诊断及血液培养阳性菌血症作为对照，计算诊断阳性率、敏感性和特异性，数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。结果 荧光定量PCR方法检测发现菌血症阳性的患者44例，阳性率为44%，明显高于血液培养的15%，差异有统计学意义(P<0.05)；以临床诊断及血液培养阳性菌血症作为对照，荧光PCR的诊断敏感性为87.9%，特异性为90.6%。结论 荧光定量16SrRNA基因检测的阳性率远高于血液培养，可为孕产妇患者感染提供早期、敏感的病原学诊断依据。

16SrRNA；孕产妇；菌血症；荧光定量聚合酶链反应

感染是妇产科患者围术期和围分娩期常见的并发症，病原菌侵入血液通过血行播散到体内各部位可造成菌血症，全身表现有发热，寒战，乏力等；局部表现有伤口红肿，渗液，化脓等。如不及时治疗可能会危及生命，因此要求早期快速准确诊断菌血症。目前用于检测血液感染细菌的方法主要是进行血液培养，但其缺点是所需时间长、阳性率低、因一次采血量较大患者的依从性也差。我们对100例住院分娩疑似感染处于菌血症状态的患者,在进行血液培养的同时应用荧光定量 PCR方法(PCR)检测细菌的16S rRNA基因，16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，其集保守性与变异性于一身， 是目前应用最广泛的分子微生物学检测的靶基因[1,2]，希望通过此项研究探索妇产科菌血症患者的早期诊断方法和治疗依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2013-01至2014-12疑似处于菌血症感染状态的患者100例。菌血症诊断指南，分为临床诊断血液感染和血液培养阳性作为确诊血液感染，临床诊断血液感染依据2001年国家卫计委《医院感染诊断标准》血液感染的临床诊断[3]。

1.2 试剂与仪器 血液培养检测采用美国BD公司9240全自动血液培养仪。荧光PCR检测采用ABI7300荧光定量PCR分析仪， PCR引物和探针依据细菌16S rRNA基因保守区域，均由浙江大学医学院儿童医院中心实验室合成。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌ATCC25923，菌株均购于卫生部临床检验中心。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 无菌条件下，取待检血液标本50 μl，分别加到1.5 ml离心管中；加入DNA提取液(10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐pH 7.6，5 mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基硫酸钠)50 μl，振荡充分混匀，37 ℃摇床摇匀30 min后置100 ℃干浴10 min, 12 000 r/min，离心5 min，取上清液备用。

1.3.2 引物与探针 选择细菌16S rRNA基因高保守的区域设计引物，在该引物的片段范围内，通过MegAlign分析软件分别设计针对所有细菌共有的通用探针，对革兰阳性菌特异的革兰阳性探针，对革兰阴性菌特异的革兰阴性探针。引物序列：上游引物(P690F)： TGTGTAGCGGTGAAATGCG (690～708 bp)；下游引物(P829R)： CATCGTTTACGGCGTGGAC(829～811 bp)。

1.3.3 PCR 抽取上清液2 μl作为模板，在ABI 7300检测仪按下列程序进行PCR反应: 94 ℃预变性2 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s为一个循环，共循环40次。每次PCR循环均设阳性和空白对照。阳性对照为大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCCC25923；空白对照不加DNA模板。

1.3.4 结果报告 将baseline曲线start值设置为7～18，荧光值设置为4000，使correlation数值介于-1.0～-0.97，FAM通道为革兰阳性菌，VIC通道为革兰阴性菌。PCR完毕计算CT 值 (Cycle Threshold)，以CT值<35判定为阳性。

1.3.5 血液培养 采用临床常规血液培养方法。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0软件，计数资料采用绝对数和率的形式表达，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 16S rRNA基因检测结果 100份标本中，基于16S rRNA基因的PCR方法的检测阳性44例，阳性率为44%。

2.2 PCR方法与血液培养检测结果的比较 100份标本中，血培养阳性16例，阳性率为16%，远低于PCR的44%，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

表1 妇产科菌血症PCR方法与血液培养检测结果比较

2.3 PCR方法与临床诊断指标的结果比较 100例中，基于临床诊断指标的阳性患者37例，阳性率为37.0%，低于PCR的检测阳性率44%，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。

表2 妇产科菌血症PCR方法与临床诊断指标的比较

2.4 诊断指标 若以临床诊断且血液培养阳性作为菌血症诊断作对照，PCR的诊断敏感性为87.9%，诊断特异性为90.6%。

3 讨 论

临床诊断妇产科菌血症的感染缺乏特异性的指标，血液培养虽然是菌血症的金标准，但其所需时间长，在出现临床症状后的数天才能发出报告，从而导致患者的依从性相对较差，而且，由于抗生素的广泛使用，血培养的阳性率也不高，因此不能满足临床上的要求，尤其对于临床症状严重如高热不退、合并其他系统症状可能存在复合感染的妇产科住院患者，甚至引起不必要的恐慌。目前临床诊断菌血症多依靠患者的临床表现，2001年国内卫生部发布了《医院感染诊断标准》作为国内医院院内感染临床诊断的试行指南，其中血液感染部分对菌血症的临床诊断做出具体规定，包括发热时体温>38 ℃或低体温<36 ℃，可伴有寒战，同时合并有下列情况之一：(1)有入侵门户或迁徙病灶；(2)有全身中毒症状而无明显感染灶；(3)有皮疹或出血点、肝脾肿大、粒细胞核左移，且无其他原因可解释；(4)收缩压<90 mmHg或较原收缩压下降超过40 mmHg。但是这些感染指标均存在特异性不足的问题，若做出病原学诊断须在临床诊断基础上，符合下述两条之一才可做出：(1)血液培养分离出病原微生物；(2)血液中检测到病原体的抗原物质。因此妇产科临床工作中对重症感染的诊断常常面临较大的压力。

在检索相关文献后我们进行此项研究，以国内浙江大学儿童医院专利试剂盒为模板，在细菌16S rRNA基因保守区内所建立的PCR分子生物学方法可检测所有细菌的16S rRNA基因片段[3，4]。本研究表明，该方法具有高度的特异性与敏感性，而且检测快速，从采集标本到PCR扩增只需4～6 h即可完成，而通常血液培养至少需要3～5 d，从而显著提高了工作效率。

本试验证明，若以临床诊断且血液培养阳性作为血液感染对照，PCR方法的诊断敏感性为87.9%,诊断特异性为90.6%，说明基于16S rRNA基因的PCR方法是一种快速准确具有潜力和价值的诊断方法。同时，通过分别合成革兰阳性探针和革兰阴性探针，可以进一步判断血液感染的病原菌为革兰阳性球菌或革兰阴性杆菌，从而为临床医师有针对性的选择抗菌药物抗感染治疗提供帮助。

本试验的数据显示, PCR方法的阳性率为44%，远高于血液培养的阳性率16%，亦高于临床诊断指标37.0%，说明PCR方法能够发现其他方法无法查到的细菌感染。PCR方法检测假阴性的原因可能在于PCR体系中血红蛋白等抑制物存在较多或抽提过程中细菌DNA的丢失而导致PCR方法假阴性[5，6]，此外，临床诊断指标特异性较低也可能影响最后的数据。

血液培养阴性及不符合临床血液感染的患者，分析原因，可能由于：(1)存在某些特殊培养条件的细菌如L型细菌等或某些无法培养的细菌[7]；(2)临床诊断指标亦存在假阴性的可能；(3)在PCR方法操作过程中有发生污染的可能性[8]。

综上所述，16S rRNA基因荧光定量PCR方法可为妇产科患者血液感染提供早期、敏感的病原学诊断依据，具有较大的临床应用前景。但是，由于本试验只涉及细菌引起的血液感染，对真菌、病毒、支原体属、衣原体属等其他病原体引起的血液感染尚不能提供诊断帮助。血培养依然是血液感染最为重要的金标准，荧光定量PCR方法不能替代传统的血液培养方法，其对临床诊断的帮助还需要进一步的研究。

致谢：感谢首都儿科研究所分子研究室王建华教授对此项研究所给予的大力支持和帮助。

[1] Peters R P, Van Agtmael M A, Danner SA,etal. New developments in the diagnosis of bloodstream infections [J]. Lancet Infect Dis, 2004, 4(12): 751-760.

[2] 吴亦栋，尚世强，李建平，等. 细菌16SrRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症 [J]. 中华儿科杂志，2007, 45 (6): 446-450.

[3] Vanden Brand M, Peters R P, Catsburg A,etal. Development of a multiplex real-time PCR assay for the rapid diagnosis of neonatal late onset sepsis[J]. J Microbiol Methods, 2014(106): 8-15.

[4] Jordan J A, Durso M B. Real-time polymerase chain reaction for detection bacterial DNA directly from blood of neonates being evaluated for sepsis [J]. J Mol Diagn, 2005, 7: 575-581.

[5] Shang S,Chen G, Wu Y,etal. Rapid diagnosis of bacterial sepsis with PCR amplification and microarray hybridization in 16SrRNA gene[J]. Pediatr Res, 2005, 58: 143-148.

[6] Deng J, Ma Z, Huang W,etal. Respiratory virus multiplex RT-PCR assay sensitivities and influence factors in hospitalized children with lower respiratory tract infections [J]. Virol Sin, 2013, 28(2): 97-102.

[7] Devine K M. Bacterial L-forms on tap: an improved methodology to generate Bacillus subtilis L-forms heralds a new era of research [J]. Mol Microbiol, 2012,83(1):10-13.

[8] Wu Y, Cheng L, Shang S,etal. Gram stain-specific-probe-based real-time PCR assay for diagnosis and discrimination of bacterial neonatal sepsis [J]. J Clin Microbiol, 2008, 46: 2613-2619.

(2016-07-20收稿 2016-09-10修回)

(责任编辑 武建虎)

Applicability of PCR methods based on 16S rRNA genes to diagnosis of infections in gynecological and obstetric patients

REN Mingbao1, LI Yang1, ZHAO Jinhui2, and LIU Jing2.1.Department of Obstetrics One，2.Department of Clinical Laboratory，Beijing Obstetric and Gynecology Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing 100026, China

Objective To develop a PCR method based on 16S rRNA genes for the diagnosis of infections among gynecological and obstetric patients in order to improve the efficiency and accuracy of bacterial detection.Methods 100 patients suspected with blood infections had their blood cultured and bacterial 16S r RNA genes were detected synchronously by extraction of DNA, primer and probe design, PCR amplification and fluorescent quantitative detection of amplified products.The positive rate, sensitivity and specificity of the two methods were compared.Results The positive rate of PCR was 44% by PCR, which was significantly higher than 15% by blood culture. Withg the criteria of positive blood culture and/or clinical diagnosis of blood infection as control, the sensitivity was 87.9% and the specificity was 90.6% for PCR.Conclusions The positive rate of PCR was significantly higher than that of blood culture and can be used as an early and sensitive index in pathogenic diagnosis of blood infections among gynecological and obstetric patients.

16S rRNA; para and grevia; blood infection; PCR

首都医科大学附属北京妇产医院科研基金(201016)

任明保，博士，副主任医师。

100026，首都医科大学附属北京妇产医院：1.产一科,2.检验科

R714