二斑叶螨危害对棉花应激防御酶活性的影响

帕提玛·乌木尔汗，陈丽慧，崔燕华，李 勇，冯宏祖*

(1.塔里木大学植物科学学院，农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站，塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室，新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏 833000)



二斑叶螨危害对棉花应激防御酶活性的影响

帕提玛·乌木尔汗1，陈丽慧1，崔燕华2，李 勇1，冯宏祖1*

(1.塔里木大学植物科学学院，农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站，塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室，新疆阿拉尔 843300；2.阿克苏地区农业技术推广中心，新疆阿克苏 833000)

探明二斑叶螨取食对棉花叶片内应激防御性酶活性的影响。在棉苗5-6叶期接种不同数量(10-40头)的二斑叶螨雌成虫，取食1-4 d后采摘不同处理的叶片，利用分光光度计测定过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、脂氧合酶(LOX)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。结果表明二斑叶螨取食后，棉花叶片CAT活性显著升高，且随诱导时间的延长其活性变化呈先上升后下降的趋势，为害3 d时，10、20、H(每株接棉蚜跟叶螨各40头)头/叶的CAT活性达到最高峰，显著高于对照(P<0.05)；POD、PAL活性也随诱导时间的延长和螨口数量的增加呈上升趋势，为害4 d时达到最高峰；而PPO、LOX活性随着时间的增加呈现上升后下降趋势，且为害2 d时达到最高峰，仍显著高于对照(P<0.05)。棉叶应激防御酶活性随着二斑叶螨为害时间与螨口密度的增加而增加，表明二斑叶螨的危害胁迫能诱导寄主植物产生一系列应激生化反应，不同的酶活性表现有所不同。

二斑叶螨；危害；棉花；防御酶活性

昆虫与寄主植物之间的复杂关系是生态学的重要组成部分，也是国际研究热点问题之一。大量的植物与昆虫协同进化研究表明，植物受到害虫的胁迫后，会积极主动地产生一系列生理生化反应来抵御害虫的为害(张廷伟等，2013)。昆虫取食诱导植物产生的防御防卫机制是多方面的，其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT) 、过氧化物酶(POD)和脂氧合酶(LOX)等防御蛋白都起着重要作用。李玉泉等(2001)研究发现，豇豆幼苗叶片在受到朱砂叶螨的刺吸后，POD、PPO和PAL 3种酶的活性均有不同程度的升高。李润植等(1998)报道棉苗受害虫危害后，CAT的活性有不同程度的升高。

二斑叶螨TetranychusurticaeKoch是为害果树、农作物、花卉和温室植物的世界性害螨。近年来在我国分布区域、危害范围逐渐扩大，已成为部分地区的重要害螨。许多学者对该螨抗药性、生物学特性和防治技术等方面进行了大量研究并取得了一定的成果。有关二斑叶螨为害导致寄主酶活性的变化方面的研究也有不少报道，如菜豆被二斑叶螨侵害后POD活性升高，并始终维持在相对较高的水平(黎志辉和鲁亚，2011)等，但为害棉花后诱导防御机制方面的研究较少(耿书宝等，2014)。有报道，二斑叶螨取食后不同棉花品种的关键酶有所变化(帕提玛等，2015)。本实验通过分析二斑叶螨取食后棉花叶片重要防御酶的变化，为揭示植物与植食性螨类之间的营养关系和选育优质的抗螨品种提供重要的生理生态学依据，也为进一步开展棉花抗螨机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试棉花品种：新陆中37

1.2 方法

1.2.1 棉花虫害诱导处理

将培养至5-6叶期的棉苗置于防虫笼中，每株棉苗接种不同数量的二斑叶螨雌成虫(接种前饥饿6 h)。设置5种处理：A笼每株接10头叶螨，B笼每株接20头叶螨，C笼每株接30头叶螨，D笼每株接40头叶螨，E笼每株接棉蚜和叶螨各40头(用“H”表示)，以同期健康未受害的棉苗为对照(CK)。接虫后1、2、3 和4 d时分别剪取3片棉花真叶，测定棉叶中的相关酶活性，各处理重复3次。

1.2.2 防御酶活性测定

粗提液提取：将称取0.2 g取回的叶片剪碎放入研钵中，加入2.5 mL、0.05 mol/L、pH7.0磷酸缓冲液(内含质量分数1%的聚乙烯吡咯烷酮) 在冰浴中研磨，匀浆液倒入10 mL的离心管中，于4℃、11000 g条件下离心20 min，取上清液用于酶活力测定。

过氧化物酶(POD)活力测定：参照Cai等(2006)方法测定。反应液为200 μL酶液，1.0 mL 体积分数0.1%的愈创木酚溶液，0.8 mL、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)及1.0 mL体积分数0.1% H2O2。30℃保温，在470 nm下测定吸光值，每隔1 min读数1次，读3次。酶活力以单位时间内单位质量的材料的光密度变化值来表示(△OD470 nm/min·g)。

过氧化氢酶(CAT)活力测定：参照Li等(2008)方法测定。反应液为0.3 mL、0.1 mol/L H2O2，1.0 mL H2O，1.5 mL、0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)及200 μL粗酶液。25℃保温，在240 nm下测定吸光值，每隔1 min读数1次，读3次。酶活力以单位时间内单位质量的材料的光密度变化值来表示(△OD240 nm/min·g)。

多酚氧化酶(PPO)活力测定：参照Kavitha等(2008)方法测定。反应液为200 μL酶液，1.3 mL、50 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0) 及1.5 mL、0.2 mol/L邻苯二酚。30℃保温在420 nm下测定吸光值，每隔1 min读数1次，读3次。酶活力以单位时间内单位质量材料的光密度变化值来表示(△OD420 nm/min·g)。

脂氧合酶(LOX)活力测定：参照Azami-Sardooei等(2010)方法测定。反应液为2.775 mL、100 mmoL/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，25 μL亚油酸，酶液200 μL，保温于30℃，在234 nm 下测定吸光值，每隔1 min读数1次，读3次。酶活力以单位时间内单位质量的材料的光密度变化值来表示(△OD234 nm/min·g)。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定：测定参照毛红等(2011)方法。称取0.3 g样品，放入预冷的研钵中，加入1.5 mL含5 mmol/L 的β-巯基乙醇的硼酸缓冲液(0.05 mol/L，pH 8.8)和0.03 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，放入适量石英砂研磨匀浆，4℃、12000 r/min离心20 min，上清液为酶粗提取液。酶活性测定反应体系为1 mL、0.02 mol/L L-苯丙氨酸，2 mL、pH8.8、0.05 mol/L 磷酸缓冲液和0.1 mL酶粗提取液，37℃水浴1 h，用6 mol/L HCl终止反应，290 nm处测定吸光值。以提取缓冲液代替酶液为空白对照。

1.3 数据处理

检验处理间的差异显著性(P<0.05)，试验数据统计用EXCEL 2003软件，数据分析采用DPS 7.5软件。

2 结果与分析

2.1 二斑叶螨为害对棉花叶片CAT活性影响

二斑叶螨取食后，棉花叶片CAT活性显著升高，且随诱导时间的延长与螨口数量的增加其活性变化均有一个先上升后下降的过程(表1)。为害3 d时，10、20、H头/叶的CAT活性达到最高峰，且10、H、40头/叶在各时间段存在极显著差异(P<0.01)。随着螨口数量的增加CAT活性也有一定的上升趋势，为害2、3、4 d时，各螨口密度处理之间CAT活性存在极显著差异(P<0.01)，均高于对照达到极显著水平(P<0.01)。与其他螨口密度相比H头/叶的CAT活性变化最小，可能是两种之间竞争力引起的。

表1 二斑叶螨为害对棉花叶片CAT活性影响(△OD240nm/min/g)

Table 1 The effect ofTetraychusurticaedamage in cotton leaves on CAT activity

螨口密度(头/叶)PopulationofTetraychusurticae为害天数(d)Harmdays1234CK1．0503±0．0235aA(cC)1．078±0．0450aA(fF)1．1010±0．0356aA(fF)0．8263±0．0566bB(fE)101．0507±0．0618dD(cC)1．3757±0．0150cC(eE)1．6313±0．0667aA(cC)1．5337±0．0629bB(cC)201．6347±0．1113bB(aA)1．5970±0．0192bB(cC)2．3500±0．0338aA(aA)1．6577±0．0367bB(bB)301．2003±0．0828bB(bB)1．9347±0．0098aA(aA)1．8737±0．0150aA(bB)1．9370±0．0217aA(aA)401．1137±0．0150dD(cBC)1．7253±0．0015aA(bB)1．5673±0．0423bB(dD)1．3650±0．0287cC(dD)H1．0543±0．1075cCB(cC)1．4790±0．0243aA(dD)1．1860±0．0768bB(eE)0．9120±0．1002dD(eE

注：对照组表示健康无虫害植株，处理组表示二斑叶螨取食处理，H处理表示每株接棉蚜和叶螨各40头；数据为平均值±标准误；同行数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著，大写字母表示在P<0.01水平差异显著；括弧中不同小写字母表示同列数据经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著，大字字母表示在P<0.01水平差异显著。下同。Note: Control group represents the healthy plants without T. urticae damage.Treatment Group represents the Tetraychus urticae feeding processing. H represents 40 mites & 40 aphids per each piece of leaf；the data in table is the mean value ± the standard deviation；after in same data, different little letters indicate by Duncan’s new multiple range test significant difference inP<0.05 level, the capital letters inP<0.01 significant level，different capital letters indicate significant difference inP<0.01 level；in parentheses the different little letters indicate the same column data by Duncan's new multiple range test significant difference inP<0.05 level，different capital letters indicate significant difference inP<0.01 level。The same in below。

2.2 二斑叶螨为害对棉花叶片POD活性影响

二斑叶螨取食后，棉花叶片POD活性高于对照，且随诱导时间的延长与螨口数量的增加其活性变化有一定上升的过程。为害4 d时都达到最高峰，但未存在显著差异(P>0.05)。二斑叶螨为害后引起了棉花叶片过氧化物酶(POD)活性的提高(表2)。

2.3 二斑叶螨为害对棉花叶片PPO活性影响

棉花受二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片PPO活性随着时间的增加而上升后下降趋势，除棉蚜和叶螨混合为害(H)外，其他处理为害2 d时达到最高峰，显著高于对照(P<0.05)。随着螨口数量的增加，棉花叶片PPO活性有上升趋势，但未存在明显的显著差异(P﹥0.05) (表3)。

表2 二斑叶螨为害对棉花叶片POD活性影响(△OD470nm/min/g)

Table2 The effect ofTetraychusurticaedamage in cotton leaves on POD activity

螨口密度(头/叶)PopulationofTetraychusurticae为害天数(d)Harmdays1234CK01797±00137bB(cC)07323±03261aA(dD)08170±01573aA(bB)08420±00173aA(cA)1006063±02897bA(bcBC)07683±03283abA(dCD)08497±05329abA(bB)08807±03647aA(bcA)2007857±04382bB(bABC)09923±05429abAB(cdBCD)12490±07732aAB(abAB)13057±06971aA(abcA)3010033±05534aA(abAB)11863±06435aA(bcBC)14640±07429aA(aAB)15327±01538aA(abA)4013487±07422aA(aA)14340±06070aA(bAB)16700±09265aA(aAB)17183±04378aA(aA)H08100±04432cC(bABC)18350±06459aA(aA)14593±07107bB(aAB)14390±05857bB(abcA)

表3 二斑叶螨为害对棉花叶片PPO活性影响(△OD420nm/min/g)

Table 3 The effect ofTetraychusurticaedamage in cotton leaves on PPO activity

螨口密度(头/叶)PopulationofTetraychusurticae为害天数(d)harmdays1234CK2．0900±0．0497aA(dD)2．4267±0．0380aA(cC)1．9687±0．1097bB(bB)1．8110±0．0504cB(bB)102．4927±0．0442bA(cC)2．6930±0．0745aA(bB)1．9877±0．0247cB(bB)1．8560±0．1015cB(bB)202．6027±0．0452aA(bAB)2．7170±0．0590aA(bB)2．1013±0．0690bB(bAB)1．8947±0．1355cB(bB)302．6390±0．0704aA(bAB)2．8987±0．0584aA(aA)2．1157±0．2334bB(bAB)1．9047±0．2167bB(bB)402．7510±0．0684aA(aA)2．9447±0．1306aA(aA)2．3880±0．1449bB(aA)2．2570±0．0080bB(aA)H2．5463±0．0361aA(bcBC)2．1340±0．2187bB(cC)2．2947±0．0289bAB(bAB)1．2887±0．1295cC(cC)

2.4 二斑叶螨为害对棉花叶片LOX活性影响

与正常未受虫害损伤的棉叶相比，在二斑叶螨持续取食棉叶1、2、3及4 d时，受损棉叶中的LOX活性均显著高于对照(P<0.01)。棉花受二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片LOX活性随着时间的增加呈先上升后下降的趋势，为害2 d时都达到最高峰，且20、30、40头/叶各时间阶段存在极显著差异(P<0.01)。随着螨口数量的增加而LOX活性有上升趋势，各螨口密度之间均存在极显著差异(P<0.01) (表4)。

2.5二斑叶螨为害对棉花叶片PAL活性影响

与正常未受虫害损伤的棉叶相比，在二斑叶螨持续取食棉叶1、2、3及4 d时，受损棉叶中的PAL活性均显著高于对照(P<0.01)。棉花受二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片PAL活性随着时间与螨口数量的增加而上升趋势，且为害4 d时都达到最高峰，为害1、2、3 d时各螨口密度之间均存在极显著差异(P<0.01) (表5)。

表4 二斑叶螨为害对棉花叶片LOX活性影响(△OD234nm/min/g)

Table 4 The effect ofTetraychusurticaedamage in cotton leaves on LOX activity

螨口密度(头/叶)PopulationofTetraychusurticae为害天数(d)harmdays1234CK1．3326±0．0150aA(fF)1．4410±0．0080aA(fF)1．0433±0．0095bB(fF)0．9540±0．1274bB(fE)101．5157±0．0073bB(eE)1．5777±0．0217aA(eE)1．2713±0．0081cC(eE)1．1820±0．0072dD(eD)201．6097±0．0012dD(dD)2．5227±0．0060aA(cC)1．7767±0．0037cC(dD)1．9517±0．0110bB(cB)301．6840±0．0017dD(cC)2．8723±0．0042aA(bB)2．3460±0．022bB(bB)1．7550±0．0212cC(dC)401．9300±0．0062dD(bB)3．2473±0．0185aA(aA)2．6413±0．0049bB(aA)2．4697±0．0015cC(aA)H2．2750±0．0010bB(aA)2．3023±0．0045aA(dD)2．0503±0．0006dD(cC)2．0757±0．0055cC(bB)

表5 二斑叶螨为害对棉花叶片PAL活性影响(△OD290nm/min/g)

Table 5 The effect ofTetraychusurticaedamage in cotton leaves on PAL activity

螨口密度(头/叶)PopulationofTetraychusurticae为害天数(d)harmdays1234CK0．7020±0．0536aA(fF)0．7130±0．0010aA(fF)0．7163±0．0006aA(fF)0．7503±0．0475aA(Cb)100．7720±0．0010bB(eE)0．7497±0．0021cC(dD)0．8090±0．0053aA(eE)0．7680±0．005bB(cB)200．8813±0．0060cC(dD)0．7543±0．0005dD(cC)0．9427±0．0006aA(dD)0．9183±0．0016bB(bA)301．3870±0．0040aA(bB)0．7543±0．0006dD(bB)1．0697±0．0122bB(bB)0．9277±0．0040cC(bA)401．5347±0．0006aA(aA)0．7543±0．0007dD(aA)1．1407±0．0055bB(aA)0．9727±0．0095cC(aA)H1．0300±0．0046aA(cC)0．7543±0．0008cC(eE)1．0377±0．0055aA(cC)0．9057±0．0341bB(bA)

3 结论与讨论

植物在进化的过程中对昆虫的为害形成了多种防御机制，其中诱导防御机制在植物自我保护中发挥重要作用。有研究证实植物的整体防御机制并不是一种简单的刺激-诱导-应激模式，而可能是一种复杂的动态过程(Bergelson and Lawton,1988)，其生理反应是通过酶的催化活动来实现，因此植物组织中酶活性的变化与植物的抗性密切相关。本研究测定二斑叶螨取食后的棉花叶片中酶活性后发现，二斑叶螨取食刺激均能诱导棉花叶片防御途径的关键酶(POD，CAT，PPO，LOX和PAL)活性发生不同程度的升高，随着二斑叶螨取食时间与螨口数量增加出现先上升后下降的趋势。说明棉花的防御系统在诱导期内发挥了防御作用，且酶活性的变化与虫口密度和为害时间密切相关。而棉蚜和棉叶螨混合种群为害棉叶中酶活力低于叶螨单一种群为害。

过氧化氯酶(CAT)是一种重要的保护酶类，它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。朱砂叶螨Tetranychuscinnabarinus侵害后豇豆幼苗初期叶片中过氧化氢酶(CAT)含量和活性升高，随着叶螨数量增加和为害时间延长其活性逐渐降低(梁为，2010)，本实验也得出相似的结果。多酚氧化酶(PPO)可促进多酚的合成，许多研究结果表明植物的抗虫性与PPO相关。毛红等(2011)研究报道绿盲蝽Apolyguslucorum取食诱导后，感性品种PPO的活性上升比抗性品种慢。在本研究中二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片PPO活性随着时间与螨口数量的增加而上升后下降。POD是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶之一，可参与木栓质和木质素的合成，也可参与酚类等化合物的氧化生成对害虫毒性更大的醌类化合物等，增加植物抗逆性(田国忠等，2001)。有研究表明，绿盲蝽取食诱导后皖棉小黄花叶片中POD活性显著增加(毛红等，2011)。植物脂氧合酶(LOX)是不含硫的过氧化物酶,由单一的多肽链组成,含有非血红素铁。褐飞虱Nilaparvatalugens剌吸导致稻株体内LOX的活性先升高后下降，并在48 h降到对照水平(刘裕强等，2005)。本研究发现棉花受二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片LOX活性随着时间的增加而上升后下降趋势，且为害2 d时都达到最高峰，表明二斑叶螨取食对棉花叶片内LOX活性有相似的诱导作用。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物体内苯基丙酸类合成途径的关键酶，能催化苯丙氨酸脱氨基形成反式肉桂酸(Jones,1984)，而肉桂酸是合成各种次级代谢产物的前体。PAL活性的升高是植物抗性的指标因子之一,参与了植物次生抗性物质(植保素、木质素和酚类物质等)的合成和积累。有研究表明，许多植物受到危害或受到伤害之后，有酚类化合物的浓度增加的现象。棉蚜危害后棉叶体内PAL活性均有不同程度的升高(姜涛等，2009)。在本实验中，棉花受二斑叶螨取食诱导后，棉花叶片PAL活性随着时间与螨口数量的增加呈上升趋势，且为害4 d时都达到最高峰，为害1、2、3 d时各螨口密度之间均存在极显著差异(P<0.01)且仍维持在较高的水平。可能伤害信号激活了植物体内防御酶基因的表达而导致了PAL活性的增长，这是植物组织对外界胁迫的抗性反应。

刺吸式昆虫取食能够在不同程度上诱导CAT、POD、PPO、LOX活性产生变化，且这种变化具有物种特异性。甜菜夜蛾Spodopteraexigua取食诱导产生的3种萜类挥发物的释放是B型烟粉虱抑制的，也降低对捕食者的吸引(Rodriguez-Saonaetal., 2003)。说明了氧化酶系在刺吸式昆虫引起的植物诱导抗性中具有重要作用。二斑叶螨刺吸取食作为一种外界胁迫能诱导棉花叶片体内CAT、POD、PPO、LOX和PAL活性发生变化，是自身抗性和植物诱导防御的内在表现；而且在同一时期内，随着虫口密度的增加CAT、POD、PPO、LOX和PAL活性也随着增加，说明外界胁迫压力越大，植物自身保护机制在一定范围内相应增强，这种酶活性的变化与寄主植物的抗虫性之间可能存在相关性, 但害螨取食诱导植物产生的防御防卫机制是多方面的，研究棉花受害后应激防御酶活性有所变化外，还应进一步研究各应激防御酶催化产物如酚类、应醌类化合物质和量的变化情况。因为植物抗性指标的筛选和确定是一个复杂的过程，从植物诱导防御的整体性和系统性方面考虑，还需要对植物品种以及其它防御酶和次生代谢物质做进一步的研究。

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Effects ofTetraychusurticaedamage on stress defense-enzymes activity of cotton

Patima Wumuerhan1,CHEN Li-Hui1, CUI Yan-Hua2, LI Yong1, FENG Hong-Zu1*

(1.College of Plant Science,Tarim University, Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar, Ministry of Agriculture, P. R. China; Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University, Alar 843300, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2. Aksu Agriculture-Technical Extension Center, Aksu 833000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China)

The effects ofTetraychusurticaedamage on stress defense-enzymes activity of cotton was compared in the paper .In the stage of 5-6 leaves of cotton seedlings inoculated different amount (10-40) of female adults, feeding 1-4 d after picking leaf of different treatment, using spectrophotometer determination of catalase (CAT), peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO) and lipoxygenase (LOX) and phenylalanine aminolyase (PAL) activity of the enzyme, the influence of Tetranychus urticae on stress of defensive enzyme activity was vertified. The results showed that after the mites feeding, the cotton leaf CAT activity increased significantly, and with the increase of induction time, activity change offered a tendency of upgrading firstly then descending latter. When harmed for 3 d, 10, 20, 40 head/leaf CAT activity peaked and significantly higher than control(P<0.05); POD, PAL activity increased following the increase of induction time extension and mite population. The peak occurred when harmed for 4 d. PPO, LOX activity offered a upgrade tendency following the increase of time firstly than descending latter. Peak occurred when harmed for 2 d and still significantly higher than control. Cotton leaf stress defense enzyme activity increased following harm time and mites population. It indicated that the mite herbivore stress can induce host plant to produce a series of biochemical reactions. Different enzyme activity performance made differently.

TetranychusurticaeKoch; harm; cotton; defense enzyme activity

国家自然科学基金(31560513)；塔里木大学研究生科研创新项目(TDGRI201507)

帕提玛·乌木尔汗，女，1986年生，哈萨克族，新疆伊犁人，在读硕士，主要从事农业昆虫与害虫综合防治，E-mail：patima530@126.com

*通讯作者Author for correspondence，E-mail：patima530@126.com

Received：2015-12-24；接受日期Accepted：2016-03-22

Q966;S433.7

A

1674-0858(2016)06-1185-07