中国西南三地HCV基因型的分布及临床特征

温先勇，唐敏，邓正华，李宝林

（西南医科大学附属医院检验科，四川 泸州 646000）

临床论著

中国西南三地HCV基因型的分布及临床特征

温先勇，唐敏，邓正华，李宝林

（西南医科大学附属医院检验科，四川 泸州 646000）

目的了解丙型肝炎病毒（HCV）基因型在四川（川）、云南（滇）、贵州（黔）等中国西南地区汉族丙型肝炎患者中的分布及临床特征，为丙型肝炎的防治提供依据。方法对221例来自川、滇、黔地区的丙型肝炎患者，采用焦磷酸测序法进行HCV基因分型并分析不同基因型丙型肝炎致病性的差异。结果①216例HCVRNA阳性的丙肝患者被成功分型，共发现1、2、3、6等4种常见基因型和1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a等7种常见基因亚型，其所占比例为：1a型5.1%（11/216）、1b型36.1%（78/216）、2a型3.7%（8/216）、2b型0.9%（2/216）、3a型7.4%（16/216）、3b型27.8%（60/216）、6a型17.1%（37/216），此外，还发现其他少见亚型（4a/6n）共4例，占1.9%（4/216）。②川、滇、黔分布前3位的基因亚型分别是3b、1b、6a和3b、1b、2a/3a及1b、6a、3b；男、女患者比例最高的亚型分别是3b（33.1%）和1b（48.3%）；＞40岁患者以1b（39.8%）、3b（18.6%）、6a（15.9%）为主；＜40岁患者以3b（37.9%）、1b（32.1%）、6a（18.4%）为主；感染方式以输血（血制品）40.1%为主，其他及不明原因者也占较大比例（33.8%）。③急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、丙肝后肝硬化和肝癌4种临床类型的丙型肝炎均以1b型比例最高，其次是3b、6a型；1b型患者的HCV载量及肝功能损害指标均高于其他亚型患者（P＜0.05）。结论川、滇、黔等中国西南部地区HCV-RNA阳性的汉族HCV感染者以1b、3b、6a为优势基因，且呈多样化分布；HCV载量较高的1b亚型，可能更容易导致患者肝功能的损害以及丙型肝炎的慢性化、肝脏的纤维化和癌变。

丙型肝炎病毒；基因型；临床特征；焦磷酸测序

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是仅次于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），导致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要因素之一。由于HCV复制所依赖的聚合酶缺乏校对功能，其基因组序列容易发生变异而呈现高度的异质性。研究人员依据HCV基因组核苷酸序列的差异，将HCV分为6种基因型大约80余种亚型[1-2]，其分布与种族、地域、性别、年龄及感染方式等多种因素有关，且各基因型引起的丙型肝炎其临床表现和转归也存在较大的差异，因此，对丙型肝炎的预防和治疗都有重要价值。泸州地处四川（川）、云南（滇）、贵州（黔）三地结合部，患者来源广泛，本文采用焦磷酸测序法对来自我国西南地区的川、滇、黔三地共221例不同临床类型的汉族丙型肝炎患者进行HCV基因分型，并比较不同亚型之间的临床差异，旨在为丙型肝炎的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年8月-2016年5月本院就诊的门诊和住院患者，包括四川（163例）、云南（25例）、贵州（33例）汉族丙型肝炎患者共计221例，完成分型216例。其中，男性127例，女性89例；年龄13～76岁，平均（49.26±15.43）岁，均符合2004年中华医学会肝病学分会、中华医学会传染病与寄生虫病学分会制订的诊断标准[3]。包括急性丙型肝炎6例，慢性丙型肝炎149例，丙型肝炎后肝硬化37例，丙肝后肝癌24例，排除其他型别的病毒性肝炎及其他导致肝脏病变的疾病，分型前所有患者未接受过抗病毒治疗。

1.2 主要仪器、试剂

1.2.1 标本处理清晨空腹采集患者EDTA-K2抗凝静脉血5 ml，2 h内室温3 300 r/min离心，分离血浆，置入-70℃冰箱冷冻保存备检。

1.2.2 HCV-RNA检测①HCV-RNA提取：取1.2.1备检血浆200 μl，采用柱式提取法在QIA cube核酸提取仪上进行（德国QIAGEN公司），试剂由广东深圳凯杰生物工程有限公司提供。②HCVRNA扩增：采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应，在ABI 7500实时荧光定量聚合酶链反应扩增仪（美国Applied Biosystems公司）上进行患者HCV-RNA扩增，试剂盒由广东深圳凯杰生物工程有限公司提供，每次实验中均设置阴性、临界阳性、强阳性对照和低值、高值质控。③HCV基因测序和分型：采用德国QIAGEN公司Pyro-Mark Q24型焦磷酸测序-遗传分析系统对HCV-RNA检测结果＞5×104IU/ml的标本进行基因测序和分型：将②操作中的扩增产物在Pyro-Mark Q24序列分析仪上测序，再用Pyro-Mark Q24分析软件对测序结果进行分析，并与标准基因型的碱基序列比较，获取被检样品的基因型别。所有试剂均由QIAGEN公司提供，操作按说明书进行。④肝功能检测：丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷氨酰转肽酶（glutamyl endopeptidase，GGT）等肝功能指标在AVDIA 2400生化分析仪上测定，仪器和试剂均由德国Siemens公司提供。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，若方差齐则用LSD-t检验作两两比较，计数资料以率表示，组间比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 221例HCV基因分型结果

221例HCV-RNA浓度＞5.0 E+04 IU/ml标本中，有216例完成分型（5例未能分型者：川4例，黔1例），各种基因分型比例从高到低依次为1b型36.1%（78例）、3b型27.8%（60例）、6a型17.1%（37例）、3a型7.4%（16例）、1a型5.1%（11例）、2a型3.7%（8例）、2b型0.9%（2例），前3种基因型占到总数的81.0%。其他少见类型包括：4a/6n等共4例（1.9%）。

2.2 川、滇、黔三地HCV基因分型结果

川、滇、黔三地基因亚型分别有8、6和5种，比例最高基因亚型分别是1b、3b、6a和3b、1b、2a/3a及1b、6a、3b。1b、3b、6a 3种优势基因亚型在川、滇、黔三地分布比较经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=3.953、1.374和4.257，P=0.146、0.502和0.132）。见表1。

表1 川、滇、黔HCV基因分型结果比较例（%）

2.3 性别、年龄、感染方式与基因型的关系

在216例HCV患者中，男性患者3b比例最高（33.1%），其次是1b型（27.6%）和6a型（18.8%）；女性患者1b比例最高（48.3%），其次是3b型（20.2%）和6a型（14.7%）。1b、3b亚型在不同性别组比较经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.771和4.304，P= 0.000和0.036），6a亚型性别比较，差异无统计学意义（χ2=0.679，P=0.438）。见表2。

表2 性别与HCV基因型的关系例（%）

在＞40岁患者中，以1b（39.8%）、3b（18.6%）、6a（15.9%）为主；而＜40岁患者则以3b（37.9%）、1b（32.1%）、6a（18.4%）为主，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.981，P=0.000），3b亚型＜40岁患者高于40岁以上患者，1b、6a亚型在此年龄分段比较，差异无统计学意义（χ2=1.415和0.021，P=0.239和0.899）。见表3。

表3 年龄与HCV基因型的关系例（%）

216例患者感染方式以输血（血制品）为主（40.1%），其他（如手术、拔牙、纹身、刺眉、性传播）及未知原因也占较大比例（33.8%）。见表4。

2.4 不同临床类型丙型肝炎基因分型结果

216例HCV分型患者中，急性丙型肝炎、慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝后肝硬化和肝癌4种临床类型均以1b型为主，其次是3b、6a型，1b、3b、6a亚型在慢性丙型肝炎、丙型肝炎后肝硬化和丙型肝炎后肝癌的分布比较经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.043、2.614和2.030，P=0.979、0.272和0.397），急性丙型肝炎组例数太少，未纳入统计学处理。见表5。

2.5 HCV患者治疗前主要肝功能指标比较

216例HCV分型患者经方差分析，1、3、6及其他型患者组之间ALT、AST、ALP及GGT等指标与HCV-RNA总体均数比较，差异有统计学意义（F= 14.632、11.587、15.2951、0.621和7.948，P=0.000），且ALT、AST、ALP、GGT及lgHCV-RNA等5组资料比较，差异无统计学意义（P=0.892、0.504、0.795、0.741和0.846），采用LSD-t检验作两两比较，1型患者ALT、AST、ALP、GGT及lg HCV-RNA等指标均高于3型（t=11.834、9.662、13.595、9.208和6.947，P= 0.000）、6型（t=10.415、8.351、9.640、8.379和7.132，P= 0.000）及其他型别（t=6.927、5.159、8.474、4.875和4.153，P=0.000）患者，但3、6及其他型别之间肝功能及HCV-RNA浓度比较，差异无统计学意义。见表6。

表4 感染方式与HCV基因型的关系例（%）

表5 不同临床类型丙型肝炎基因分型结果例（%）

表6 不同基因型的丙型肝炎患者部分临床指标比较（±s）

表6 不同基因型的丙型肝炎患者部分临床指标比较（±s）

基因型ALT/（u/L）AST/（u/L）ALP/（u/L）GGT/（u/L）lg HCV-RNA 1（n=89）69.42±15.0560.16±14.08103.70±24.1356.92±18.256.76±0.77 3（n=76）45.80±14.7941.55±13.6361.32±27.4934.95±14.026.03±0.74 6（n=37）42.54±13.8737.26±16.8167.53±23.1731.23±16.305.75±0.79其他（n=14）41.79±15.3640.57±16.8859.46±21.4135.54±15.015.94±0.73

3 讨论

HCV属于黄病毒科单股正链RNA肝炎病毒，基因组序列容易发生变异，其中基因型和基因亚型最具流行病学和临床价值。国际上通常采用阿拉伯数字（1～6）表示基因型，英文小写字母（如1a、1b等）表示基因亚型[4]。

HCV基因型在不同地域分布存在明显的差异。文献显示，亚洲及我国大部分地区流行的HCV型别为1b，其次为2a，但近几年由于流动人口和献血者、涉毒人员等因素，原有基因型分布状况正迅速发生改变[5]。研究其分布及其变化、致病规律，对丙型肝炎的防治有重要价值。

笔者采用焦磷酸测序法对221例丙肝患者进行分型，成功分型者有216例，共检出1、2、3、6共4种常见基因型和1a、1b、2a、2b、3a、3b、6a共7种基因亚型，另外，检出了少见的4a型1例及6n型3例，未发现5型患者；西南地区的川、滇、黔3地患者总体上以1b型（36.1%，78/216）为主，与全国大部分地域的基因型分布相似[6-8]。但其3b型（27.8%，60/216）和6a型（17.1%，37/216）2型的比例却远高于中国北方及南方一些省市[7-8]，与重庆地区相似[9]。3地之间优势基因有一定差异：四川和云南均以3b、1b为优势基因，6a和3a次之，贵州以1b、6a为主，3b次之。3b和6a的感染被认为与外部人员流动和涉毒有关的亚型[10]，在边境省份云南及其邻近的四川等地、男性及＜40岁以下的年轻患者中占有很高的比例；而1b的感染则被认为多与输血（血制品）有关，在人员流动相对较小的贵州、女性及＞40岁以上的患者中占有比例最高，同时，四川亚型的种类还呈现较滇、黔两地更为多样化的特点。

不同HCV基因型在临床上的致病性也存在明显差异。从引起急慢性丙型肝炎、丙型肝炎后肝硬化、肝癌等病变的基因来看，1型（1a、1b）和基因3型（3a、3b）分别占到了83.3%、73.8%、78.4%和87.5%，提示基因1型和基因3型较其他基因型更易导致丙型肝炎的慢性化和患者肝脏纤维化及癌变，与国内文献报道的结果相似[11]（P＜0.05）。本实验检测结果还表明，1b亚型患者体内HCV-RNA含量、主要肝功能脏损害指标（ALT、AST、ALP、GGT）高于其他亚型（P＜0.05），说明携带高浓度的1b亚型HCV，对肝脏的损害程度大于其他亚型。所以，研究HCV基因型特点可以在了解丙型肝炎的流行病学特点、临床特征、防治等诸多方面发挥作用。

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（申海菊 编辑）

Distribution and clinical features of HCV genotypes in three areas in southwest China

Xian-yong Wen,Min Tang,Zheng-hua Deng,Bao-lin Li
(Clinical Laboratory,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To study the distribution of hepatitis C virus(HCV)genotypes in the hepatitis C patients of Han nationality in Sichuan,Yunnan and Guizhou so as to provide evidence for prevention and treatment of hepatitis C.Methods HCV in 221 patients were detected by pyrophosphate sequencing method for genotyping,then the differences in pathogenicity of HCV with different genotypes were compared.Results In the 216 HCV-RNA positive patients from Sichuan,Yunnan and Guizhou,there were 4 kinds of genotypes (1,2,3 and 6)and 7 kinds of subgenotypes(1a,1b,2a,2b,3a,3b and 6a).The subgenotypes 1a,1b,2a, 2b,3a,3b and 6a accounted for 5.1%(11/216),36.1%(78/216),3.7%(8/216),0.9%(2/216),7.4%(16/216), 27.8%(60/216)and 17.1%(37/216).In addition,there were 4 cases of rare subtypes(4a/6n),accounting for 1.9%(4/216).The top 3 gene subtypes were 3b,1b and 6a in Sichuan;3b,1b and 2a/3a in Yunnan;and and 1b,6a and 3b in Guizhou respectively.3b(33.1%)and 1b(48.3%)were the main subtypes in the male and female patients respectively;1b(39.8%),3b(18.6%)and 6a(15.9%)were the main subtypes in the patients over 40 years while 3b(37.9%),1b(32.1%)and 6a(18.4%)were the main subtypes in the patients younger than 40 years.The main mode of infection was blood transfusion(40.1%),and other unknown reasonsalso accounted for a large proportion(33.8%).1b was the main subtype in acute hepatitis C,chronic hepatitis C,liver cirrhosis after hepatitis C and liver cancer after hepatitis C,followed by 3b and 6a.In the patients with hepatitis C,the liver function impairment indicators and HCV load of the 1b subtype were significantly higher than those of other gene subtypes(P＜0.05).Conclusions HCV subtype 1b is the most predominant subtype in hepatitis C patients of Han nationality in Sichuan,Yunnan and Guizhou of southwest China.3b and 6a subtypes also occupy a very high proportion;and the distribution of gene subtypes is diversified.1b subgenotype of high HCV load is more likely to cause serious damage of liver function and chronic hepatitis, liver fibrosis and hepatic carcinoma.

hepatitis C virus;genotype;clinical feature;pyrophosphate sequencing

R512.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.009

1005-8982（2016）23-0042-05

2016-07-12