血红素结合蛋白通过上调HO—1改善大鼠脑缺血再灌注后神经行为学

董贝贝　张智申　谢克亮　于泳浩

【摘要】 目的 探讨血红素结合蛋白（HPX）是否通过上调血红素氧合酶-1（HO-1）改善大鼠脑缺血再灌注（IR）损伤。方法 60只雄性SD大鼠， 7～8周龄， 体重250～280 g， 采用随机数字表法分为五组：假手术（Sham）组、缺血再灌注（MCAO）组、溶剂（叠氮钠）（MCAO+Vehicle）组、HPX（MCAO+HPX）组和HO-1抑制剂组（MCAO+HPX+ZnppⅨ）组， 每组12只。采用大脑中动脉栓塞（MCAO）法制备大鼠缺血再灌注模型， MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠分别在IR即刻经侧脑室单次注射生理盐水（10 μl， 0.9%）、叠氮钠（10 μl， 0.1%）、HPX（10 μl， 1.86 g/L）和10 μl HPX+ZnppⅨ混合液（HPX 1.86 g/L+叠氮钠0.1%）。IR后24 h、7 d分别采用Carcia评分法评价大鼠神经行为学评分（NBS）， 采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测半暗带区脑组织中HO-1 mRNA水平。结果 IR后24 h Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+ HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠的NBS评分分别为（15.50±2.43）、（5.17±1.60）、（5.00±2.10）、（10.83±1.47）、（5.33±1.97）分， 比较差异有统计学意义（F=34.819， P<0.05）；IR后7 d Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+ HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠的NBS评分分别为（16.83±1.60）、（8.83±3.31）、（9.17±3.19）、（12.50±3.08）、（9.33±2.07）分， 比较差异有统计学意义（F=13.113， P<0.05）。与Sham组相比， MCAO组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平显著增加（P<0.05）；与MCAO组相比， MCAO+Vehicle组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平无明显变化（P>0.05）；与MCAO+Vehicle组大鼠相比， MCAO+HPX组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平显著升高（P<0.05）。结论 HPX可通过上调HO-1表达改善大鼠脑缺血再灌注后神经行为学表现。

【关键词】 脑缺血再灌注损伤；血红素结合蛋白；血红素氧合酶-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.29.193

Hemopexin in HO-1 up-regulation for improving rat neuroethology after cerebral ischemia reperfusion injury DONG Bei-bei， ZHANG Zhi-shen， XIE Ke-liang， et al. Department of Anesthesiology， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China

【Abstract】 Objective To investigate whether or not hemopexin （HPX） can improve rat cerebral ischemia reperfusion（IR） injury by its heme oxygenase-1 （HO-1） up-regulation. Methods A total of 60 male SD rats， aging 7～8 weeks and weighting 250～280 g， were divided by random number table into sham operation （Sham） group， ischemia reperfusion （MCAO） group， solvent （sodium azide） （MCAO+Vehicle） group， HPX （MCAO+HPX） group and HO-1 inhibitor （MCAO+HPX+ ZnppⅨ） group， with 12 rats in each group. Middle cerebral artery occlusion （MCAO） was applied to prepare model of rat ischemia reperfusion. MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group received respectively single injection through paracele immediate at IR by normal saline （10 μl， 0.9%）， sodium azide （10 μl， 0.1%）， HPX （10 μl， 1.86g/L） and 10 μl HPX+ZnppⅨ （HPX 1.86 g/L+ sodium azide 0.1%）. Carcia evaluation was applied in 24 h and 7 d after IR for neurobehavior score （NBS）， along with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） for HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue. Results In 24 h after IR， Sham group， MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group had NBS scores respectively as （15.50±2.43）， （5.17±1.60）， （5.00±2.10）， （10.83±1.47） and （5.33±1.97） points， and the difference had statistical significance （F=34.819， P<0.05）. In 7 d after IR， Sham group， MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group had NBS scores respectively as （16.83±1.60）， （8.83±3.31）， （9.17±3.19）， （12.50±3.08） and （9.33±2.07） points. Their difference had statistical significance （F=13.113， P<0.05）. Comparing with Sham group， MCAO group had obviously higher HO-1mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P<0.05）. Comparing with MCAO group， MCAO+Vehicle group had no obvious change in HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P>0.05）. Comparing with MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group had remarkably higher HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P<0.05）. Conclusion HPX can improve rat neurobehavioral manifestation after ischemia reperfusion by its HO-1 up-regulation.

【Key words】 Cerebral ischemia reperfusion injury； Hemopexin； Heme oxygenase-1

对脑卒中患者进行溶栓治疗会发生再灌注损伤， 缺血再灌注损伤涉及到氧化应激[1]、细胞凋亡[2]、线粒体紊乱[3]等诸多机制 ， 针对上述机制进行干预的效果并不理想。过多的游离血红素有强烈的细胞毒性， 能够造成内皮损伤[4]， HPX能够清除过多游离血红素， 而HO-1是游离血红素代谢的关键限速酶。作者的前期动物实验研究显示：HPX 在中枢神经系统的神经元和脉管上皮细胞均有表达， 侧脑室注射HPX可缩小大鼠脑梗死容积[5]。然而国内外针对HPX的神经保护作用及其机制的研究相对缺乏， 因此本实验在前期研究基础上， 探讨HPX是否通过提高HO-1表达改善脑缺血再灌注损伤后行为学表现， 为促进脑卒中患者的认知功能恢复提供新思路。

1 材料与方法

1. 1 实验动物来源 成年雄性SD大鼠60只， 7～8周龄， 体重250～280 g， 购自中国军事医学科学院实验动物中心， 许可证号：SCXK（军）2009-003。分笼饲养于无特殊病原菌环境：温度（22±2）℃， 相对湿度约55%～60%， 每日12 h昼夜交替， 自由饮食、饮水。采用随机数字表法将其分为五组：Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+ HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组， 每组12只。本研究已获天津医科大学实验动物管理委员会批准。

1. 2 脑缺血再灌注模型制备 采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型， 参照文献所述[6]， 10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉， 暴露并分离右侧颈总动脉（CCA）， 右颈外动脉（ECA）及颈动脉分叉， 直视下用眼科剪于CCA距离动脉分叉5～15 mm处剪一小口， 右手改用眼科镊持准备好的栓线（购自北京西浓科技有限公司）经此小口置入CCA内向前送入颅内， 至稍感阻力， 拉紧固定栓线。待栓塞1 h大鼠苏醒后， 采用Longa法[7]评估大鼠行为表现， 评分1～3分提示造模成功。Sham组大鼠相同条件下暴露分离右侧CCA， 右侧ECA及颈动脉分叉， 结扎右侧CCA和ECA， 但不插入栓线， 关闭切口。手术过程中使用电热毯维持大鼠体温， 使其直肠温度维持在（37.0±0.5）℃。

1. 3 方法 参照文献所述[8]， MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ 组大鼠分别在IR后即刻在立体定位仪下经侧脑室注射方式单次给予生理盐水（10 μl， 0.9%）、叠氮钠（NaN3）（10 μl， 0.1%）、HPX（10 μl， 1.86 g/L）和10 μl HPX+ZnppⅨ混合液（HPX 1.86 g/L+0.1%叠氮钠）。

1. 4 观察指标

1. 4. 1 NBS评分 参照文献所述[9]， IR后24 h、7 d采用Carcia评分法由一个不了解本研究实验分组情况的研究人员评价各组大鼠NBS评分。该评分法分为运动功能和感觉功能评价两方面， 最高18分， 最低3分， 得分越高说明动物的神经行为表现越好， 得分3～7分说明重度神经功能障碍， 8～11分为中度神经功能障碍， 12～18分为轻度神经功能障碍。

1. 4. 2 RT-PCR法检测缺血半暗带区HO-1 mRNA水平变化 Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组和MCAO+HPX组， 每组选取6只大鼠， 水合氯醛深麻醉， 然后进行左心室灌注， 直至肝脏色发白， 右心耳开口处流出的灌注液体基本变成清亮， 这时可认为灌注有效。经灌注死亡后断颈取大鼠缺血半暗带脑组织， 提取总RNA， 反转录合成cDNA， 使用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR检测， 以GAPDH为内对照。HO-1引物长度77bp， 上游引物5′-CGACAGCATGTCCCAGGATT-3′， 下游引物5′-TCGCTCTATCTCCTCTTCCAGG-3′；GAPDH引物长度95 bp， 上游引物5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′， 下游引物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。用iQTM多重实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司， 美国）进行扩增并分析处理数据。用2-ΔΔCT法计算mRNA相对表达量。

1. 5 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 组间比较用单因素方差分析， 两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 NBS评分 IR后24 h Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+ HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠的NBS评分分别为（15.50±2.43）、（5.17±1.60）、（5.00±2.10）、（10.83±1.47）、（5.33±1.97）分， 比较差异有统计学意义（F=34.819， P<0.05）；IR后7 d Sham组、MCAO组、MCAO+Vehicle组、MCAO+ HPX组、MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠的NBS评分分别为（16.83±1.60）、（8.83±3.31）、（9.17±3.19）、（12.50±3.08）、（9.33±2.07）分， 比较差异有统计学意义（F=13.113， P<0.05）。与Sham组相比， MCAO组大鼠在IR后24 h和7 d的NBS评分显著降低（P<0.05）；与MCAO组相比， MCAO+Vehicle组大鼠在IR后24 h和7 d的NBS评分无明显变化（P>0.05）；与MCAO+Vehicle组相比， MCAO+HPX组大鼠IR后24 h和7 d的NBS评分显著升高（P<0.05）；与MCAO+HPX组相比， MCAO+HPX+ZnppⅨ组大鼠IR后24 h和7 d的NBS评分显著降低（P<0.05）。见图1。

2. 2 缺血半暗带组织HO-1 mRNA水平 与Sham组比较， MCAO组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平显著增加（P<0.05）；与MCAO组比较， MCAO+Vehicle组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平无明显变化（P>0.05）；与MCAO+Vehicle组比较， MCAO+HPX组大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗带区脑组织HO-1 mRNA水平显著升高（P<0.05）。

3 讨论

大脑中动脉是颈内动脉的直接延续， 是血管缺血闭塞发生率最高的动脉分支；然而大脑中动脉提供大脑半球约80%的血供， 一旦发生闭塞， 造成的临床症状更加广泛严重。因此本研究通过采用经典的MCAO法建立大鼠脑IR模型， 这与临床上缺血性脑卒中发生的特点相一致。多种神经行为学评价方法比较表明， Carcia评分法与缺血性脑卒中大鼠的梗死容积有更好的相关性[10]， 因此本研究采用Carcia评分法评价大鼠IR后的神经行为学表现。本研究结果显示， 与Sham组相比， MCAO大鼠IR后24 h和7 d的NBS明显降低， 侧脑室注射HPX能明显的提高大鼠IR后24 h和7 d的NBS评分， 给予HPX时同时给予HO-1抑制剂ZnppⅨ后， HPX提高大鼠IR后的NBS评分的作用消失；大鼠IR后24 h和7 d的NBS评分降低到HPX治疗前的水平， 侧脑室注射叠氮钠对大鼠IR后24 h和7 d的NBS评分无明显影响， 表明HPX能够有效改善大鼠IR后的神经功能缺损， 提高其神经行为学表现， HO-1可能是HPX发挥神经功能保护作用的关键分子。

游离血红素为亲脂性结构， 主要用于血红蛋白、细胞色素P450、过氧化氢酶等的合成， 同时也还是调节这些蛋白基因表达的重要因子。然而越来越多的研究发现， 过多的游离血红素有强烈的细胞毒性作用， 该毒性作用在血管内皮细胞和神经元中最为显著， 多种组织损伤时伴随游离血红素的过度释放[11]。游离血红素的亲脂性结构特点使其能够很容易的插入血管内皮细胞膜脂质分子中， 破坏内皮结构的完整性， 与此同时， 游离血红素还参与了血管内皮的氧化应激、炎症反应， 从而引起血管内皮功能障碍[12]。HPX是血浆中与游离血红素亲和力最强的蛋白， 可清除过多有害游离血红素。作者前期研究表明HPX在脑缺血后的脉管系统中表达增加， 侧脑室注射HPX能够呈剂量依赖性显著缩小大鼠的脑梗死容积[5]。HO-1是催化血红素分解的限速酶， 其作为机体内源性的保护因子， 是细胞应激最敏感的指标之一， 对多种血管源性损伤发挥保护作用[13]。缺血再灌注损伤发生时HO-1的表达增加， 外源性导入HO-1基因载体， 缺血再灌注后24 h动物神经行为学评分明显升高， 组织病理改变减轻， 梗死面积减少[14]。

本研究结果显示， 与Sham组相比， MCAO大鼠IR后24 h缺血半暗带区的HO-1 mRNA应激性增加， 在IR后7 d下降到手术前水平；侧脑室注射HPX能够显著上调大鼠IR后24 h缺血半暗带区的HO-1 mRNA的转录水平， 该作用能持续到IR后7 d；给予HPX时同时给予HO-1抑制剂ZnppⅨ， 阻止了神经行为学改善， 表明HPX通过上调HO-1表达改善脑缺血再灌注后行为学表现。

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[收稿日期：2016-10-09]