谷朊粉糖基化改性对其结构及溶解性的影响

宋永令 李江河 王若兰

(河南工业大学粮油食品学院；粮食储藏与安全教育部工程研究中心；粮食储运国家工程实验室，郑州 450001)

谷朊粉糖基化改性对其结构及溶解性的影响

宋永令 李江河 王若兰

(河南工业大学粮油食品学院；粮食储藏与安全教育部工程研究中心；粮食储运国家工程实验室，郑州 450001)

本试验使用葡聚糖对谷朊粉进行干法糖基化改性。研究了反应温度、时间以及糖与谷朊粉的配比对反应接枝物溶解度的影响，优化了制备最佳溶解度接枝物的工艺条件。同时研究了接枝物在不同pH以及温度条件下的稳定性。并通过傅里叶红外光谱(FTIR)和电子显微镜(SEM)扫描方法证实了糖基化的发生及糖蛋白结构的变化。结果表明，在反应温度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反应时间12 d(288 h)的条件下接枝物的溶解度最高，为1.923 mg/mL。在pH较高或较低以及谷朊粉等电点等情况下，接枝物的功能特性均处于较高水平，且具有良好的稳定性。通过红外扫描分析可知，改性后蛋白质的二级结构发生了很明显的改变，其β折叠有所减少，α螺旋、转角结构的含量得到一定程度的增加，而糖基化改性对无规则卷曲结构的影响不大，通过电镜扫描分析可知，糖基化改性后蛋白质的分子体积增大。

谷朊粉 葡聚糖 干法糖基化 溶解度

谷朊粉又称活性小麦面筋，作为小麦加工生产淀粉的副产物，每年都有大量的谷朊粉产生。由于其适中的价格，作为蛋白质资源它常常与牛奶和大豆蛋白成为竞争对手[1]。目前，谷朊粉广泛用于固体食物，但在液体食品(如饮料、奶制品)中的应用是有限的。这主要是由于谷朊粉富含疏水性氨基酸(如谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸)，导致蛋白质结构中有较大的疏水区。因此，谷朊粉的溶解性、乳化性及发泡性不能满足食品加工的需求。而溶解性是蛋白质的重要性能之一，它可能会影响蛋白质的其他功能特性，如乳化性、凝胶性等。因此，改善谷朊粉的溶解特性，拓宽其应用范围具有重要的意义。

通过美拉德反应制备蛋白-多糖复合物是改善蛋白质功能特性的一项新方法，此方法具有反应条件温和、不添加其它化学试剂等优点。目前对于蛋白质-多糖复合物在提高蛋白质的溶解性，乳化能力和乳化稳定性等方面已有研究报道。布冠好等[2]研究发现，通过糖基化修饰大豆蛋白后，其功能特性包括溶解性、乳化特性、凝胶特性、热稳定性及过敏原性均有所改善。赵艳娜等[3]的研究也发现，乳清蛋白与乳糖结合后，其抗氧化能力有了大幅度的提高，甚至其还原能力还要高于VC和BHA。任仙娥等[4]分别采用3种不同的糖对谷朊粉进行湿法糖基化改性。结果表明，改性后谷朊粉的溶解性、乳化性、表面疏水性均有不同程度的提高。

蛋白质常用的糖基化方法主要有2种：干法和湿法。湿热法较干热法相比，条件相对简单，反应速率快，主要用于蛋白质与单糖或双糖的接枝反应，而与多糖进行反应的报道相对较少，有研究表明，多糖的加入较单糖与双糖更能提高蛋白质的功能性质[5]。本研究采用干法来制备谷朊粉与葡聚糖的糖基化接枝产物，优化制备具有较好溶解性的糖基化反应条件，并对改性的机理进行了初步探究，旨在拓宽谷朊粉改性的途径，为植物蛋白的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试验原料

谷朊粉：封丘县华丰粉业有限公司；葡聚糖(AR)：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 主要试验仪器及设备

TU-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；Hitachi S-4300扫描电镜 ：日本日立公司；WQF-510傅里叶红外光谱仪：美国Thermo Nicolet公司；LGJ-10C型冷冻干燥机：北京市四环科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 接枝物制备[6]

称取一定量的谷朊粉，溶于pH为12的磷酸缓冲溶液中，使其浓度为10 mg/mL。以一定比例将谷朊粉与葡聚糖(m/m)进行混合，振荡直至溶解完全。对混合液进行冷冻干燥，然后把得到的样品放置在底部为饱和KBr溶液的密封干燥器内(相对湿度为79%)，再分别放置在不同温度的恒温箱内反应，定时取样。得到的反应产物放入冰箱内冷冻保存，待测。

1.3.2 溶解度测定[7-8]

a.双缩脲试剂配制：取1.5 g CuSO4·5H2O和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)，用500 mL蒸馏水溶解，在搅拌下加入300 mL的10%NaOH (m/V)，用水稀释到1 000 mL，贮存于塑料瓶中(或内壁涂有石蜡的玻璃瓶中)。

b.蛋白质溶解度的测定：配制1%(m/V)接枝物溶液，平衡30 min，在离心机上以3 000 r/min 离心10 min。静置，取上清液1 mL于试管中，加入4 mL双缩脲试剂，剧烈振荡10 min，静置放置30 min。取1个试管先加入1 mL蒸馏水，再加入4 mL双缩脲作为空白试验，于540 nm处进行比色测定，以牛血清蛋白的溶解度作标准曲线。

c.牛血清蛋白溶解度标准曲线的绘制：配制浓度为20 mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，并分别移取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL于试管中，不足1.0 mL者用蒸馏水补齐至1.0 mL。再将各试管中加入4.0 mL双缩脲试剂，然后用上述蛋白质溶解度的测定方法分别测定其吸光值。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，做标准曲线，方程为y=0.049x+0.002，相关系数R2为0.998。

1.3.3 接枝产物在不同pH条件下的稳定性

将制备的接枝物溶于去离子水，使其质量浓度为5 mg/mL。然后用0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液来调节溶液pH，使其值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再测定接枝物的溶解度随pH的变化。

1.3.4 接枝产物在不同温度条件下的稳定性

将接枝物溶于去离子水，使其浓度为5 mg/mL，然后将其放到水浴锅中，使其温度为30、40、50、60、70、80、90 ℃，再分别测定接枝物的溶解度随温度的变化。

1.3.5 傅里叶红外光谱分析[9]

先将谷朊粉以及接枝物进行充分干燥，再将样品与KBr质量比为1:300的比例进行混合，充分碾磨，压制成薄片。利用红外光谱仪做全波段扫描(400～4 000 cm-1)，扫描12次。

1.3.6 扫描电镜分析[10]

对谷朊粉以及接枝物进行充分干燥，取少量的样品粘贴到样品台的导电胶上，真空条件下在导电胶表面喷金，利用扫描电镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 干法糖基化反应的单因素研究

以葡聚糖为糖基供体，分别对反应温度、反应时间、蛋白多糖比例进行单因素试验，根据糖基化谷朊粉溶解性的高低初步确定反应条件。

2.1.1 反应温度对接枝物溶解度的影响

如图1所示，糖基化谷朊粉溶解性随反应温度升高呈现先增加后降低的趋势，反应温度对糖基化产物具有显著影响，当反应温度为60 ℃附近时接枝物的溶解度最高。糖基化是在蛋白质氨基酸侧链上引入糖基，一方面糖基的引入增加了蛋白质中亲水性基团的数量，从而使蛋白质达到更好的亲水亲油性的平衡，另一方面，糖基的引入可以阻碍蛋白质分子聚集，从而提高蛋白溶解性。在一定范围内随反应温度升高，谷朊粉与糖共价交联速度加快，蛋白质结构展开，提高大分子表面活性，增加接枝物亲水性，从而提高其溶解性；但当反应温度继续升高超过一定程度时，蛋白质开始聚集变性，分子中部分亲水性基团被覆盖，导致接枝物的溶解性开始下降。张波等[11]在对糖基化对大豆蛋白乳化性研究结果中显示温度达到一定程度时，其复合物的乳化性也会出现下降趋势，此结果与本研究相一致。

图1 不同反应条件对接枝物溶解度的影响

2.1.2 葡聚糖/谷朊粉对接枝物溶解度的影响

蛋白和多糖的分子间共价结合是在一定的基团间进行的，适当的反应物配比不仅可以提高反应的速度和最终的反应程度，而且还可以减少副反应(如焦糖化)的发生[11]。图1显示出，葡聚糖/谷朊粉对接枝物的溶解性的影响比较明显。葡聚糖/谷朊粉(m/m)质量比小于275%时，随着葡聚糖的增加，接枝物的溶解性不断增加，大于275%时，溶解性开始下降。这可能是由于糖比例的增大提高了蛋白质自由氨基与糖分子还原末端的羰基之间的接触几率，接枝度升高；然而，随着糖含量的继续增加，溶液的黏度增加和空间位阻效应明显，接枝度降低。王成波[12]在对玉米谷蛋白-葡萄糖复合物溶解性研究结果也显示，谷蛋白/葡萄糖质量比并不是越大越好，而是有一个最佳的值。那治国等[13]以米糠谷蛋白和葡聚糖为原料进行干法糖基化改性，研究表明蛋白/糖为1∶5时，反应得到的复合物的接枝度最高。

2.1.3 反应时间对接枝物溶解度的影响

如图1曲线所示，反应时间对枝结物溶解性的影响比较明显。随着反应时间的延长，枝结物的溶解性逐渐增加，反应时间为10 d时，接枝物的溶解性最好。但是反应时间超过10 d之后，枝结物的溶解性开始下降，这种变化趋势与王成波[12]研究玉米谷蛋白-葡萄糖复合物溶解性的变化相一致。这是因为随着反应时间的延长，糖基化反应比较充分，但是时间太长美拉德反应的一些中间产物可能会抑制该反应的进行，溶解性反而不是很好。

2.1.4 响应面法优化制备最佳溶解度接枝物的工艺条件

根据上述单因素试验结果与实际生产要求选取合适的因素水平，并根据螺旋中心组合设计原理，采用软件 Design Expert 7.1中Box-Behnken模型对反应条件进行优化，各因素水平编码表如表1所示。

表1 三因素三水平响应面分析水平编码表

接枝物溶解度的试验结果见表2。其中所得数据均为3次重复试验的平均值。

利用分析软件对表2中的数据进行回归分析，得出了葡聚糖和谷朊粉接枝物溶解度(Y)与反应温度(X1)、谷朊粉与葡聚糖配比(X2)、反应时间(X3)的回归方程。

表2 试验结果

接枝物：Y=+1.87-0.077×X1+0.10×X2+0.29×X3-0.10×X1×X2-0.14×X1×X3-0.035×X2×X3-0.40×X12-0.49×X22-0.44×X32

表3为所建回归方程的方差分析。表中，葡聚糖与谷朊粉的接枝物溶解度回归方程模型F检验极显著(P<0.01)，表示所建模型与试验数据拟合良好，试验误差较小。而所建模型的失拟P值均大于0.05，不显著，表明其它因素对所建模型的影响较小，能充分反映各反应因素之间的关系以及数据的情况。所以建立的模型可以对试验进行准确的分析和预测。

表3 葡聚糖接枝物溶解度方差分析

注：P<0.01 极显著(**)；P<0.05 显著(*)；P>0.05 不显著。

图2 葡聚糖接枝物溶解度两因素交互响应面分析

为了更直观地表现2个因素同时对接枝物溶解性的交互作用，根据回归方程，作出响应面立体图，运用SAS 软件对二次回归模型进行规范分析，以任意2个因素为考查对象，剩余1个因素水平值取为0，进行降维分析，得到二元二次方程绘出响应面图及等高线图形，如图2所示。

由图2可以看出，具有较好溶解度的葡聚糖与谷朊粉接枝产物的反应时间集中在零水平后，而反应温度以及葡聚糖/谷朊粉集中在零水平附近。葡聚糖与谷朊粉反应需要较高的温度以及较长的时间，这是由于葡聚糖的分子量太大造成的。从等高线图中可以看出，反应温度与葡聚糖/谷朊粉，反应温度与反应时间的交互作用不显著，反应时间与葡聚糖/谷朊粉的交互作用显著。同时，有利于葡聚糖与谷朊粉糖基化接枝物溶解度的反应温度范围为：57～62 ℃；葡聚糖/谷朊粉范围为：250%～310%；反应时间范围为：9～15 d。各因素对接枝物溶解度影响的大小顺序为：反应时间﹥葡聚糖/谷朊粉﹥反应温度。

2.1.5 工艺优化及试验验证

根据响应面条件的优化，得出葡聚糖与谷朊粉糖基化反应的最佳条件为：反应温度59.13 ℃，葡聚糖/谷朊粉 (m/m)283.17%，反应时间11.75 d，此时的溶解度为1.93 mg/mL。根据实际将条件设定为反应温度59 ℃，葡聚糖/谷朊粉(m/m)280%，反应时间12 d(288 h)。

将优化后设定的实际反应条件做3组平行试验得到表4，从表中可以看出各糖接枝物溶解度的平均值与理论值之间的误差均小于1%，说明了优化条件的准确性。

表4 接枝物溶解度试验验证表

2.2 接枝产物在不同pH及温度条件下溶解度的稳定性

2.2.1 接枝产物在不同pH条件下溶解度的稳定性

由图3可知，在pH 3～12的范围内，干法糖基化复合物的溶解度都有提高，谷朊粉的等电点附近(pH 为7～8)时，谷朊粉的溶解度只有0.4 mg/mL左右，而糖基化接枝产物的溶解度均达到2.0 mg/mL以上，提高非常显著。这主要是由于多糖链的引入，使得蛋白的亲水基团数量大大增加，蛋白质的溶解度得以显著改善；另一方面，随着pH值的变化，接枝物溶解度变化比未糖基化谷朊粉溶解度的变化要相对平缓，这说明糖基化改性能提高接枝物的抗酸碱能力。

图3 pH对接枝物溶解度的影响

2.2.2 接枝产物在不同温度条件下溶解度的稳定性

温度条件在一定范围内对谷朊粉的溶解性起到促进作用，这是由于在适当范围内升高温度有助于蛋白质分子结构的展开，提高蛋白质分子的分散能力，从而提高其溶解度。但是随着温度的增加，蛋白质分子过分展开，大量疏水性氨基酸暴露出来，使蛋白质的溶解度有下降的趋势[14]。图4为谷朊粉和接枝物溶解性随温度的变化。可以看出，谷朊粉在温度达到60 ℃附近时，其溶解性开始下降，说明蛋白质开始变性，70 ℃附近时，蛋白质变性严重，蛋白质分子间聚集沉淀导致其溶解度急剧下降。接枝物在70 ℃附近时，溶解度开始出现下降，这说明接枝物的变性温度推迟，而且与未糖基化的谷朊粉相比，其溶解度下降比较缓慢，这可能是由于葡聚糖具有大分子的空间稳定作用，使得蛋白分子受到阻碍，不易靠近而聚集沉淀，使其溶解度下降比较缓慢。这说明糖链的接入提高了蛋白质的热稳定性。徐彩虹[15]研究发现，大豆 7S 球蛋白经过糖基化后热变性温度得到了提高，此结论与本研究结果相一致。

图4 温度对接枝物溶解度的影响

2.3 红外分析

傅里叶红外光谱是常用的分析蛋白质结构的方法之一，可以灵敏反映出肽链结构的变化。图5为通过傅立叶红外扫描后可得到谷朊粉和接枝物的红外图谱。蛋白质与多糖分子以共价键接枝后，一个典型的特征就是蛋白质分子的羟基含量增加，在红外光谱表现为羟基的特征吸收增强[16-17]。羟基的特征吸收峰有2个，分别是—OH伸缩振动吸收峰(3 700～3 200 cm-1)和伸缩振动吸收峰(1 100～1 000 cm-1)，接枝产物和未糖基化的谷朊粉在3 700～3 200 cm-1和1 100～1 000 cm-1处都有较强的吸收，但接枝物吸收强于谷朊粉，由此可以说明由于葡聚糖糖链上存在多个羟基，其通过共价键接入谷朊粉肽链上后，增加了肽链中羟基数量。

图5 谷朊粉及葡聚糖接枝物红外图

蛋白质的红外光谱图谱有几组特征吸收谱带：酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带，其中能够反映蛋白质二级结构变化的为酰胺Ⅰ区1 600～1 700 cm-1范围[18]。其中β折叠的吸收峰处于1 600～1 640 cm-1之间，而无规则卷曲的吸收峰在1 640～1 650 cm-1之间，处于1 650～1 670 cm-1的吸收峰代表为α 螺旋的存在，1 680～1 685 cm-1之间的吸收峰可以反映出转角结构。对所得的光谱图利用软件PeakFit依次进行去卷积、分峰、拟合处理，得到酰胺Ⅰ带的红外拟合曲线图6。再根据不同峰所反映出的结构，计算峰面积，得到各结构所占蛋白质二级结构的比重如表5所示。

图6 谷朊粉及接枝物酰胺Ⅰ带红外拟合曲线

结构类型二级结构中的占比/%谷朊粉葡聚糖接枝物β折叠结构37.9433.03无规则卷曲14.2713.07α螺旋结构25.7027.73转角结构22.0926.17

由表5可以看出，经过干法糖基化改性以后，接枝物的二级结构中β折叠结构含量减少，α螺旋结构含量少量上升，蛋白质的转角结构含量也有一定的提高，同时对比蛋白的无规则卷曲比例，发现改性前后差别不大。总体来说，糖基化改性后，蛋白质的有序结构增加。这一研究结果与布冠好等[19]研究大豆蛋白-葡萄糖复合物的抗原性及结构特性时所得结论一致。理论上蛋白质在加热过程中，蛋白质肽链受到热振荡，保持蛋白质空间结构的次级键主要是氢键被破坏，分子内部有序排列被解除，从而导致蛋白质分子结构的展开，会使蛋白质的无序结构增加。但是糖基化反应条件温和，温度较低，并没有使蛋白质肽链受到过分的热振荡，无规则卷曲比例增加并不明显。同时，从图6酰胺Ⅰ带的红外拟合曲线图可以看出，接枝物与谷朊粉相比，在1 600～1 640 cm-1区间，在相同波数时，接枝物的吸收峰普遍高于谷朊粉，而在1 650～1 685 cm-1区间，在相同波数时，接枝物的吸收峰则普遍比谷朊粉低，这说明蛋白质二级结构的 β-折叠有部分转化为 α-螺旋结构或转角结构。徐彩虹[15]在研究大豆球蛋白糖基化枝接改性及其热聚集行为时，得出相似的结论。

2.4 电镜扫描

经扫描电镜对接枝物以及谷朊粉进行扫描后的到图7。

a葡聚糖接枝物 b谷朊粉

图7 谷朊粉及接枝物的扫描电镜图

图7可以看出，谷朊粉和干法接枝物的微观结构明显不同。通过同等倍数放大后可以看出，谷朊粉的微观结构为小粒状，分子之间结合程度低，分子体积较小。对比谷朊粉而言，接枝物的分子间发生大量的结合聚集现象，接枝物呈大块状。这也说明了接枝反应后，葡聚糖与谷朊粉相结合，从而将谷朊粉分子团团围住，形成了体积更大的接枝物分子。这与管军军等[20]以及那治国等[13]的研究结果一致。

3 结论

单因素试验结果表明，反应温度、反应时间、谷朊粉/葡聚糖的质量比均对制备接枝物的溶解性影响显著(P<0.01)。

研究了反应温度、时间以及糖与谷朊粉的配比对反应接枝物溶解度的影响，并利用Box-Behnken模型对反应条件进行了优化，方差分析表明所建模型与试验数据拟合良好，试验误差较小。通过对模型的验证，最终获得溶解性最好的反应条件为：温度为59 ℃，葡聚糖/谷朊粉为280%，反应时间为12 d(288 h)，此时溶解度为1.923 mg/mL。

考察了糖基化接枝物在不同pH值和不同温度条件下稳定性，研究结果显示，谷朊粉等电点、谷朊粉溶解性下降迅速，而接枝物的下降相对缓慢；随着温度的升高，接枝物表现出很好的热稳定性。

红外光谱分析一方面证明了美拉德反应的发生，另一方面表明糖链的加入使蛋白质分子的空间结构发生改变，改变谷朊粉的溶解特性。扫描电镜显示，谷朊粉和接枝物的微观结构明显不同，谷朊粉呈现小粒状，而接枝物由于多糖的引入，使得蛋白分子结构变大，呈大块状。

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Structure and Solubility of Gluten-Polysaccharide Conjugates

Song Yongling Li Jianghe Wang Ruolan

(School of Food Science and Technology Engineering Research Center of Grain Storage and Security of Ministry of Education Grain Storage and Logistics National Engineering Laboratory, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

In this experiment, the modification of gluten via dry-heated Maillard reaction with dextran was studied. The effects of reaction temperature, time and the ratio of sugar to gluten on the solubility of the protein-polysaccharide conjugates were studied, and the process conditions for the preparation of glycoprotein with optimum solubility were optimized. The stability of the protein-polysaccharide conjugates at different pH and temperature was also studied. The glycosylation actions and the structure changes of the protein-polysaccharide conjugates were confirmed by infrared spectroscopy (FTIR) and scanning electron microscopy (SEM). The results showed that the solubility of the protein-polysaccharide conjugates was highest of 1.923 mg/mL under the reaction condition of the temperature 59 ℃, time 12 d(288 h) and dextran/gluten(m/m)280%. The functional properties of the modified protein were in a high level, and had good stability in the case of pH higher or lower, as well as the isoelectric point of gluten. The infrared spectroscopy showed the structure of the modified protein had a very obvious change, including the decrease of β-fold, the increase of α-helix and β-turn structure at a certain degree. But the glycosylation had little effect on the Irregular coiled structure. The scanning electron microscopy showed that the volume of modified protein was increased.

gluten, Dextran, dry glycosylation, solubility

TS21

A

1003-0174(2016)12-0125-08

河南工业大学校高层次人才基金(2012BS023)，河南省高等学校重点科研项目(15A550001)

2015-05-22

宋永令，女，1981年出生，讲师，粮食储藏理论与技术