水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工艺及油脂聚集状态的研究

李 杨 齐宝坤 隋晓楠 马文君 王中江 江连洲

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工艺及油脂聚集状态的研究

李 杨 齐宝坤 隋晓楠 马文君 王中江 江连洲

(东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030)

采用乙醇冷浴破乳法对水酶法提取大豆油过程中形成的乳状液和水解液进行破乳研究，确定乙醇冷浴破乳最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%，酶解液与乙醇体积比1∶1，冷浴温度-30 ℃，冷浴时间30 min。对常温乙醇破乳、冷冻解冻破乳、乙醇冷浴破乳3种方法进行比较，发现采用乙醇冷浴破乳法优势明显，具有较高破乳率(93.64%)和游离油得率(88.79%)。通过显微切片观察可知，对乳状液进行常温乙醇破乳和冷冻解冻破乳后，仍有一小部分油滴存在于油水界面间剩余的黏稠物中不能被释放；而采用乙醇冷浴破乳可使起乳化作用的蛋白质等物质变性沉淀，油水界面已经不存在黏稠物，几乎达到完全破乳。此外，与乳状液相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，这说明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被释放。

水酶法 大豆油 乙醇冷浴破乳 油脂聚集状态

水酶法作为一种新兴的植物油脂提取技术，是在机械破碎的基础上，对油料组织以及脂蛋白、脂多糖等复合体进行酶解，从而使油脂游离出来[1]。采用水酶法提取大豆油过程中，降解产物不会与提取物发生反应，酶解条件温和，可以有效的保护大豆油品质[2]。然而由于大豆中含有蛋白质、磷脂等两性大分子物质的存在，使富含油/水的生物酶法提油体系中不可避免的形成乳状液，这对游离油的提取造成了很大的阻碍。乳状液中的蛋白质、磷脂及多糖均对水酶法提取过程中形成的乳状液具有稳定作用[3]。具有双亲性的水溶性蛋白质趋向于吸附在油水界面处形成一层稳定的蛋白质膜，进而阻断了油脂的聚结释放[4]。Bos等[5]研究表明磷脂具有很强的表面活性，同时会显著地影响乳状液的稳定性，多糖的存在会使乳状液黏度增大或形成水相凝胶，使油滴之间分离开，降低油脂的聚集释放。

乳状液破乳的方法包括化学破乳、物理破乳和生物破乳[6]。近年来对水酶法乳状液破乳的研究很多，乙醇破乳法能够使乳状液中起乳化作用的蛋白质完全变性，导致蛋白质的乳化能力完全丧失，使得乳状液完全破乳且油脂充分释放。冷冻解冻破乳法使乳状液中油相结晶，导致乳状液稳定性下降，从而达到破乳的目的[7]。刘琪等[8]研究发现乙醇破乳可以大幅度提高游离油得率，且乙醇体积分数和乙醇添加量对破乳率有很大影响。Lamsal等[9]采用冷冻解冻法对生物酶法提取大豆油乳状液的破乳进行研究，在最佳条件下破乳率达到80%～90%。

本试验将乙醇破乳法和冷冻解冻破乳法相结合，对水酶法提油过程中形成的乳状液和水解液的破乳工艺进行研究，确定乙醇冷浴破乳最佳工艺条件，并利用光学显微镜对常温乙醇破乳、冷冻解冻破乳、乙醇冷浴破乳3种方法中油脂聚集状态进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆片：哈尔滨市九三油厂；Alcalase 2.4L碱性蛋白酶：丹麦novo公司；乙醇：天津市天力化学试剂有限公司。

立式植物粉碎机：上海伟业仪器厂；双螺杆挤压机MY146×2：东北农业大学(自制)；精密电动搅拌机：江苏省金坛市医疗器械厂；电热恒温水浴箱：北京市用光明医疗器械厂；pHS-3C型酸度计：上海雷磁仪器厂；LDZ5-2型台式低速离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-52A旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；光学显微镜：德国Leica公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

大豆片→清理→粉碎→水分调节→挤压膨化→粉碎→膨化产物→加水混合→酶解→灭酶→离心分离→酶解液(乳状液、水解液)→乙醇冷浴破乳→离心分离→旋转蒸发→游离油 ↓

游离油

1.2.2 乙醇冷浴破乳工艺单因素试验

向酶解液中加入一定体积的乙醇，在一定的冷浴温度下进行冷浴反应，然后离心分离得游离油。乙醇冷浴破乳工艺基本条件为：乙醇体积分数80%，乙醇与酶解液体积比1∶1，冷浴温度-20 ℃，冷浴时间30 min。在其他条件不变的情况下，以破乳率(%)和游离油得率(%)为考察指标，选取乙醇体积分数为60%、70%、80%、90%、100%，乙醇与酶解液体积比为1∶0.5、1∶0.75、1∶1、1∶1.25、1∶1.5，冷浴温度为0、-10、-20、-30、-40 ℃，冷浴时间为10、20、30、40、50 min，进行单因素试验，考察不同乙醇冷浴反应条件对破乳率和游离油得率的影响，并确定破乳最佳工艺条件。

1.2.3 不同破乳法中油脂聚集状态分析

在相同的酶解条件下，分别采用常温乙醇破乳法、冷冻解冻破乳法及乙醇冷浴破乳法对酶解液(乳状液、水解液)进行破乳处理，利用光学显微镜对破乳前后油脂聚集状态进行观察，分析比较3种不同破乳过程中油脂释放情况。

1.2.4 酶解液基本成分测定

蛋白质含量测定参照GB/T 5009.5—2003，油脂含量测定参照AOAC 995.19法[10]，磷脂含量测定参照GB/T 5537—2008 钼蓝比色法[11]，水分含量测定参照GB/T 5009.3—2003。

1.2.5 破乳率和游离油得率测定

游离油得率=

1.2.6 显微切片观察

显微制片方法参照关正君等[12]的方法，对酶解液中脂肪球进行苏丹Ⅲ染色，对蛋白质进行考马斯亮蓝染色，利用光学显微镜进行显微切片观察。

1.2.7 统计分析

每个试验重复3次，结果表示为平均数x±s。数据统计分析采用SPSS V17.0软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，采用软件Origin8.0作图。

2 结果与分析

2.1 乳状液和水解液成分分析

在研究水酶法提取大豆油乙醇冷浴破乳工艺之前，对乳状液和水解液的成分进行测定，各成分含量见表1。

表1 乳状液和水解液成分分析/%

由表1可知，乳状液中油脂质量分数高达54%，水解液中油脂质量分数为15%，水酶法提取出的油脂大部分存在于乳状液和水解液中，没有以游离油形式提取出来，因此有必要进行破乳处理。乳状液和水解液中磷脂对乳状体系的稳定性有影响，从而影响游离油得率。

2.2 乙醇冷浴破乳工艺单因素分析

2.2.1 乙醇浓度对破乳率和游离油得率的影响

图1为乙醇浓度对破乳率和游离油得率的影响。由图1可知，随着乙醇浓度的增大，破乳率和游离油得率逐渐上升，当乙醇体积分数达到80%时，破乳率和游离油得率最大，继续提高乙醇体积分数，破乳率和游离油得率反而下降。随着乙醇浓度的不断增加，具有乳化作用的蛋白质变性程度增大，导致其乳化性减弱或丧失，使乳化体系的稳定性被打破，释放出油脂[13]。选择最佳乙醇体积分数为80%。

图1 乙醇浓度对破乳率和游离油得率的影响

2.2.2 乙醇添加量对破乳率和游离油得率的影响

图2为乙醇添加量对破乳率和游离油得率的影响。由图2可知，破乳率和游离油得率随乙醇添加量的增大呈先上升后下降的趋势，当酶解液体积：乙醇体积为1∶1时，破乳率和游离油得率达到最大，当乙醇体积比例进一步增大时，破乳率和游离油得率开始降低。乙醇添加量增加可使乙醇与蛋白质接触面积增大，引起蛋白质变性加剧，导致其乳化性减弱，使油脂释放。选择最佳酶解液与乙醇体积比为1∶1。

图2 乙醇添加量对破乳率和游离油得率的影响

2.2.3 冷浴温度对破乳率和游离油得率的影响

图3为冷浴温度对破乳率和游离油得率的影响。由图3可知，冷浴温度在0～-30 ℃时，破乳率和游离油得率呈上升趋势，在-30 ℃时达到最大，冷浴温度低于-30 ℃后，破乳率和游离油得基本不变。温度降低时引起乳化体系中起到乳化作用的蛋白质变性[14]，导致其乳化性减弱，使得油脂聚集并释放；当温度继续降低，使蛋白质完全变性，已完全变性的蛋白质不受温度的影响，破乳率和游离油得率几乎不变。选择最佳冷浴温度为-30 ℃。

图3 冷浴温度对破乳率和游离油得率的影响

2.2.4 冷浴时间对破乳率和游离油得率的影响

图4为冷浴时间对破乳率和游离油得率的影响。由图4可知，随着冷浴时间的延长，破乳率和游离油得率逐渐增大后趋于平缓，当冷浴时间为30 min时，破乳率和游离油得率达到最大，再继续延长冷浴时间，破乳率和游离油得率也没有明显变化。冷冻时间延长到一定值时，蛋白质变性程度不再发生变化，导致破乳率和游离油得率不再增加。选择最佳冷浴时间为30 min。

图4 冷浴时间对破乳率和游离油得率的影响

通过单因素试验分析可知，乙醇冷浴破乳最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%，酶解液与乙醇体积比1∶1，冷浴温度-30 ℃，冷浴时间30 min。

2.3 不同破乳方法的比较

在相同的酶解条件下，分别采用常温乙醇破乳法、冷冻解冻破乳法及乙醇冷浴破乳法对酶解液(乳状液、水解液)进行破乳处理，不同破乳方法的游离油得率见表2。由表2可以看出，采用乙醇冷浴破乳法比以往常用的破乳法优势明显，具有较高的破乳率和游离油得率，分别为93.64%和88.79%。乙醇冷浴破乳法比常温乙醇破乳法的游离油得率提高了近17%，比冷冻解冻破乳法的游离油得率提高了12%，这说明乙醇冷浴破乳法破乳效果好，能够使油脂最大程度的释放出来，进而提高提油率，有必要对破乳前后的油脂聚集状态进行观察，分析其油脂释放机理。

表2 不同破乳方法的破乳率和游离油得率/%

2.4 破乳过程中油脂聚集状态分析

利用光学显微镜对破乳前后乳状液和水解液油脂聚集状态进行观察，采用苏丹Ⅲ对脂肪球进行染色，观察脂肪球在破乳前后的变化状态，并进行理论分析。

图5为乳状液破乳过程中油脂聚集状态。由图5a可以看出，采用水酶法工艺离心后得到的游离油较少且形成的乳状液较多；通过微观结构观察可知，水酶法得到的未破乳的乳状液中脂肪球粒径较小，且被蛋白等其他物质包裹，同时呈分散状态，不能以游离油的形式提取出来。由图5b可以看出，将乳状液进行常温乙醇破乳，离心后还存在部分乳状液未破乳；通过微观结构观察可知，油滴脂肪球粒径有所增大，另一部分脂肪球粒径依然较小，且脂肪球没有形成较大油滴，少部分油脂被释放出来。由图5c可以看出，将乳状液进行冷冻解冻破乳，离心后乳状液中大部分油脂被释放；通过微观结构观察可知，乳状液中脂肪球粒径进一步增大且发生聚集形成较大油滴被释放，但一小部分油滴存在于油水界面间剩余的黏稠物中不能被释放[15]。由图5d可以看出，将乳状液进行乙醇冷浴破乳，离心后乳状液中油脂几乎全部被释放；通过微观结构观察可知，乳状液中脂肪球粒径急剧增加，并且聚集形成肉眼可见的大油滴，同时，起乳化作用的蛋白质等物质变性沉淀，油水界面已经不存在黏稠物，几乎达到完全破乳。

图5 乳状液破乳前后油脂聚集状态

图6为水解液破乳前后油脂聚集状态。由图6a可以看出，水酶法得到的未破乳的水解液中仍存在很多粒径较小且呈现分散状态的脂肪球，不能以游离油的形成提取出来。由图6b和图6c可以看出，对水解液分别进行常温乙醇破乳和冷冻解冻破乳后，水解液中部分脂肪球粒径变大，但仍有很多脂肪球被包裹，不能聚集形成较大油滴，难以被释放出来。由图6d可以看出，对水解液进行乙醇冷浴破乳后，水解液中大多数脂肪球粒径急剧增大，并以较大油滴的形式存在，通过离心能够得到游离油，游离油得率大大提高，此时破乳率最高。与乳状液中脂肪球分布状态(图5)相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，这说明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被释放。

图6 水解液破乳前后油脂聚集状态

3 结论

对水酶法提取大豆油过程中形成的酶解液(乳状液和水解液)进行乙醇冷浴破乳，通过单因素试验分析，确定乙醇冷浴破乳最佳工艺条件为：乙醇体积分数80%，酶解液与乙醇体积比1∶1，冷浴温度-30 ℃，冷浴时间30 min。通过常温乙醇破乳、冷冻解冻破乳、乙醇冷浴破乳3种方法对乳状液和水解液进行破乳，发现采用乙醇冷浴破乳法优势明显，具有较高的破乳率和游离油得率，在最佳破乳工艺条件下，破乳率为93.64%，游离油得率为88.79%。通过显微切片观察可知，未破乳的乳状液中脂肪球粒径较小且呈现分散状态，常温乙醇破乳和冷冻解冻破乳可以使乳状液中大部分脂肪球粒径增大，且发生聚集形成较大油滴被释放，但一小部分油滴存在于油水界面间剩余的黏稠物中不能被释放。采用乙醇冷浴破乳可使乳状液中脂肪球形成肉眼可见的大油滴，同时，起乳化作用的蛋白质等物质变性沉淀，油水界面已经不存在黏稠物，此时破乳率最高。此外，与乳状液相比，水解液中的脂肪球暴露的更多，且彼此靠的更近，这说明水解液中脂肪球更易于聚集成油滴而被释放。

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Research on Demulsification Process by Ethanol Cold Bath for Aqueous Enzymatic Extraction of Soybean Oil and State of Oil Aggregation

Li Yang Qi Baokun Sui Xiaonan Ma Wenjun Wang Zhongjiang Jiang Lianzhou

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Haerbin 150030)

Demulsification of emulsion and hydrolysate in the process of enzymatic extraction of soybean oil by the method of ethanol cold bath was researched. The optimum technological conditions of ethanol cold bath demulsification were determined as follows: Ethanol concentration was 80%, volume ratio of enzymatic hydrolysate and ethanol was 1∶1, cold bath temperature was-30 ℃, and cold bath time was 30 min. It was found that ethanol cold

bath demulsification with higher demulsification rate (93.64%) and free oil yield (88.79%) had obvious advantage by comparison between normal temperature ethanol demulsification, freeze thawing demulsification and ethanol cold bath demulsification. A small part of the oil droplets still existed in the remaining sticky between oil-water interface using the method of normal temperature ethanol demulsification and froze thawing demulsification by microscopy. While using ethanol cold bath demulsification could make the protein substances with emulsification denaturation and form precipitation, as a result, there was no sticky between oil-water interface, which achieved almost completely demulsification. Moreover, compared with emulsion, more fat globules in the hydrolysate exposed and got closer to each other, which showed that fat globule in the hydrolysate was easier to gather to form oil drops and to be released.

aqueous enzymatic method, soybean oil, ethanol cold bath demulsification, state of oil aggregation

TS224

A

1003-0174(2016)12-0079-06

黑龙江省教育厅自然科学基金面上项目(12531049)

2015-05-05

李杨，男，1981年出生，副教授，粮食油脂及植物蛋白工程

江连洲，男，1960年出生，教授，粮食油脂及植物蛋白工程