固定化脂肪酶催化大豆油酯交换制备生物柴油

陈俊燕 陆向红 聂 勇 计建炳

(浙江工业大学化学工程; 浙江省生物质燃料利用技术研究重点实验室，杭州 310014)

固定化脂肪酶催化大豆油酯交换制备生物柴油

陈俊燕 陆向红 聂 勇 计建炳

(浙江工业大学化学工程; 浙江省生物质燃料利用技术研究重点实验室，杭州 310014)

以大豆油为原料，以Novozym 435固定化脂肪酶为催化剂，采用滴加甲醇的方法制备生物柴油。考察了甲醇滴加速度、水的添加量、反应温度、反应级数对脂肪酸甲酯收率的影响。结果表明，甲醇滴加可以减弱甲醇对酶的毒害，达到添加叔戊醇相同的效果。甲醇的滴加速度、反应温度对脂肪酸甲酯收率有很大影响，可以调节甲醇的滴加速度和反应温度提高脂肪酸甲酯收率，甲醇滴加速度3.43×10-4g甲醇/(g油·min)，反应温度60 ℃是适宜的反应条件，在此条件下，产物收率可以达到98.75%。反应生成的甘油会影响酶的活性和产物收率，采用二级反应，级间脱除甘油，有利于产物收率的提高。对于Novozym 435固定化脂肪酶，水的添加不利于产物收率的提高。

滴加甲醇法 Novozym 435 酯交换 脂肪酸甲酯

生物柴油是一种可再生的清洁能源，能替代矿物柴油直接用于柴油发动机[1-2]。在当前能源和环境的双重压力下，发展生物柴油有利于经济的发展和国家能源安全[3]。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯，是由动植物油通过酯化/酯交换方法制备得到[4]。目前生物柴油的生产工艺主要有化学催化法、酶催化法和高温高压法。化学催化法主要使用酸、碱为催化剂，碱催化法对原料中游离脂肪酸和水含量有严格限制；酸催化法存在醇油比高、腐蚀设备和污染环境等问题；高温高压法存在能耗高、设备投资大等缺点。酶催化法具有反应条件温和、生产过程清洁等优点[5-6]。但酶成本高，若能采用固定化酶，易于分离、可实现多次循环使用，降低酶的消耗[7]；并且酶的活性易受反应物甲醇和副产物甘油的影响，若能在操作工艺上降低甲醇/甘油对酶活性的影响，酶催化法将成为具有前景的生物柴油生产方法[8]。

李俐林等[9]以菜籽油作原料，反应介质叔丁醇和油脂的体积比为 1∶1，甲醇与油脂的摩尔比为4∶1，1%的Novozym 435和3%的Lipozyme TLIM结合使用，35 ℃下反应12 h，生物柴油得率可达95%，试验证明加入有机溶剂以及分批加入甲醇等均能有效提高反应体系中脂肪酶的催化活性。郑妍等[10]以叔戊醇作为反应介质，固定化脂肪酶Novozym 435催化大豆油与甲醇的酯交换反应制备生物柴油，在40 ℃条件下反应15 h，生物柴油得率可达97%。在前人的研究工作中，脂肪酸甲酯得率可观，为了进一步探索反应过程中分离甘油能否促进反应向正方向进行，缩短反应时间，试验考察了级间脱除甘油反应对脂肪酸甲酯收率的影响；为了降低能源损耗，简化后续分离步骤，研究了无溶剂体系下采用滴加甲醇法制备脂肪酸甲酯。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆油：食品级；甲醇(分析纯)：上海振兴试剂一厂；Novozym 435固定化脂肪酶：诺维信公司；十一酸甲酯标样、十七酸甲酯标样：阿拉丁试剂公司。

1.1.2 仪器与设备

BT100-2J型蠕动泵：保定兰格恒流泵有限公司；SHA-B恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司；Agilent7890A气相色谱仪：美国安捷伦公司；电子天平：莫多利斯科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶的预处理

将2%(基于大豆油的质量)的Novozym 435固定化酶浸入10 g大豆油中过夜，大豆油起到活化酶的作用，使酶的活性中心暴露在表面，提高催化活性。

1.2.2 酶催化酯交换反应

把装有大豆油和酶的100 mL锥形瓶放入恒温振荡水槽中，再用蠕动泵以恒定的速度向锥形瓶中加入甲醇，进行酯交换反应。每隔1 h取样，用气相色谱分析产物中脂肪酸甲酯的含量。

1.2.3 分析和计算方法

采用气相色谱分析大豆油脂肪酸甲酯组成。根据标样和脂肪酸甲酯组分的峰面积，通过内标法计算得出混合脂肪酸甲酯的含量。气相色谱条件和甲酯含量的计算方法参见文献[11]。

由气相色谱分析获得的脂肪酸甲酯的含量及反应体系的质量计算反应体系中生成的脂肪酸甲酯的质量，并按式(1)计算脂肪酸甲酯的收率。

收率=反应生成的脂肪酸甲酯质量/原料大豆油质量×100%

(1)

2 结果与讨论

2.1 稀释剂种类及甲醇加入方式对脂肪酸甲酯收率的影响

为了降低甲醇对脂肪酶的毒害作用，一般在反应体系中加入体积为大豆油1～1.5倍的叔戊醇稀释。加入的叔戊醇必须在反应结束后通过蒸馏的方法脱除，既提高了设备投资又增加了能耗。为了在不增加能耗的前提下降低甲醇对脂肪酶的毒害，以反应产物之一的棕榈酸甲酯代替叔戊醇作为稀释剂，或者采用甲醇滴加的方式降低反应体系中甲醇的浓度，试验比较了几种操作方式对脂肪酸甲酯收率的影响，结果见图1。

注：□0.875 g叔戊醇/g油，甲醇一批加入；△0.956 g棕榈酸甲酯/g油，甲醇一批加入；◇无溶剂，甲醇滴加，滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)；○无溶剂，甲醇一批加入；其他反应条件：温度40 ℃，含水量0%。

图1 稀释剂种类及甲醇加入方式对脂肪酸甲酯收率的影响

从图1可以看出，在不加稀释剂的情况下，甲醇一次性加入致使体系中甲醇浓度过高，脂肪酶受甲醇的影响而丧失催化活性，脂肪酸甲酯的收率极低；叔戊醇的加入不仅降低了体系中甲醇浓度，稀释了甲醇对脂肪酶的毒害，而且叔戊醇增加了甲醇和油的互溶度，除固定化酶外，反应呈均相体系，醇油接触面增加，反应速率提高。以棕榈酸甲酯为稀释剂，能在一定程度上稀释甲醇对酶的毒害，但和叔戊醇为稀释剂的情况相比，脂肪酸甲酯的收率要低很多，可能的原因是甘油酯与甲醇的酯交换反应是可逆反应，体系中加入棕榈酸甲酯，虽然减弱了甲醇对酶的毒害，保持了酶的催化活性，但提高了产物的浓度，抑制了正反应的进行，使脂肪酸甲酯收率下降。甲醇滴加入反应体系，可以降低反应体系中甲醇浓度，减弱甲醇对酶的毒害，有效提高脂肪酸甲酯的收率。因为没有稀释剂的加入，后续处理简单，能耗降低，甲醇滴加是一种酶催化生产生物柴油较合理的操作方式。

2.2 甲醇滴加速度对脂肪酸甲酯收率的影响

考虑到体系中的甲醇浓度会从脂肪酶的活性和反应物间的碰撞次数2个方面影响反应速率和产物收率，并且这2种影响是相反的，当甲醇滴加速度过快，体系中大量的甲醇会加速酶的失活，而甲醇滴加速度过慢，体系中甲醇浓度过低，甘油酯分子与甲醇分子的碰撞次数过少，甘油酯的转化速率降低，脂肪酸甲酯的收率下降。因此甲醇滴加速率是必须考察的一个因素。甲醇滴加速率对脂肪酸甲酯收率的影响见图2。

注：甲醇滴加速度分别为△3.84×10-4g/(g油·min)；□3.43×10-4g/(g油·min)；◇2.72×10-4g/(g油·min)；○1.70×10-4g/(g油·min)；其他反应条件：温度40 ℃，含水量0%。

图2 甲醇滴加速度对脂肪酸甲酯收率的影响

图2显示，甲醇滴加速度从3.84×10-4g/(g油·min)降低到1.70×10-4g/(g油·min)，酯交换速率先增加后下降，在甲醇滴加速度为3.43×10-4g/(g油·min)时，酯交换速率最快，生物柴油收率最高，在600 min时，生物柴油收率达到49.57%，接近叔戊醇为稀释剂的60.71%。

2.3 多级反应对脂肪酸甲酯收率的影响

酯交换反应是个可逆反应，从反应平衡的角度出发，为提高生物柴油的收率，必须增加反应体系中反应物甲醇的含量或者降低副产物甘油的含量。因为过高的甲醇含量对酶有毒害作用，试验采用多级反应，级间脱除甘油的方法提高生物柴油收率。在实际操作中，由于采用了甲醇滴加方式，体系中甲醇浓度较低，又没有其他稀释剂的存在，甘油在油相中的溶解度极低，极易通过沉降分层的方法脱除。

试验采用两级操作，在第一级酯交换反应接近平衡时，通过沉降分层脱除甘油，油相和固定化脂肪酶进入第二级，滴加甲醇进行二级酯交换反应。结果见图3。

注：□ 一级酯交换；◇二级酯交换；其他反应条件为温度40 ℃，甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)，含水量0%。

图3 分级反应对脂肪酸甲酯收率的影响

如图3所示，第一级反应在600 min后收率增加极缓，反应渐趋平衡。脱除甘油后的油相，继续用第一级反应所用的酶催化进行第二级反应，360 min后，脂肪酸甲酯收率提高了5%多。说明在一级反应生成的副产物甘油不仅抑制了反应向正方向进行，而且它附着在酶制剂的表面抑制了酶的催化作用。

2.4 水含量对脂肪酸甲酯收率的影响

微量水对维持酶的构象、发挥催化作用是必须的[12]。脂肪酶含有适量的水份，有利于提高脂肪酶的活性。

为了考察含水量对脂肪酸甲酯收率的影响。在优化的甲醇滴加速度下，将不同质量分数的水和甲醇混合经蠕动泵滴加到反应体系中进行比较，结果见图4。

注：含水量分别为□0%；◇0.2%；△0.5%；○1%；其他反应条件：温度40 ℃，甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)

图4 含水量对脂肪酸甲酯收率的影响

图4显示，含水量在0.2%～1%内，随着含水量的增加，脂肪酸甲酯的收率不断降低，并且在实验所考察的含水量下，脂肪酸甲酯的收率均低于原酶。可能是原有的固定化脂肪酶已经含有使之达到最高活性的必需水，再继续加入水会导致酶空间构象的改变，从而导致脂肪酶的活性降低甚至失活。

2.5 温度对脂肪酸甲酯收率的影响

温度影响酶的活性，进而影响酶催化生成脂肪酸甲酯的收率。试验考察了反应温度对酶催化生成生物柴油收率的影响，以获得适宜的酶促反应温度。温度对生物柴油收率的影响见图5。

注：温度分别为+40 ℃；*45 ℃；○50 ℃；△55 ℃；□60 ℃；◇65 ℃；其他反应条件：甲醇的滴加速度3.43×10-4g/(g油·min)，含水量0%。

图5 温度对脂肪酸甲酯收率的影响

如图5所示，当酶促温度从40 ℃增加到60 ℃，脂肪酸甲酯收率增加，酶促温度继续增加到65 ℃，脂肪酸甲酯的收率略有下降。温度在60 ℃时，经过550 min的反应时间，脂肪酸甲酯收率高达98.75%，能达到生产的要求。尽管较高的酶促温度会激发酶短期内的催化活性，但从长期来看必会影响酶的寿命，需进一步考察酶的寿命与酶促反应温度的关系，并结合温度对短期活性的影响，综合考虑选择酶促反应的温度。

3 结论

酶催化酯交换反应合成生物柴油的过程速率和产品收率受酶活性的影响，酯交换反应中的反应物甲醇和产物甘油对脂肪酶有毒害作用，反应体系中添加稀释剂能有效减弱甲醇对脂肪酶的毒害，提高产物转化率，但增加了后续分离的难度和成本。以产物成分之一的棕榈酸甲酯作为稀释剂，能保护酶的活性同时避免了额外的分离过程，但增加了体系中产物浓度，不利于正反应的进行，产物收率不高。甲醇滴加的操作方式不仅有利于酶活性的保持，而且加入反应体系中的甲醇基本上反应完全，甲醇用量接近于化学计量，用量少，甲醇回收能耗低。甲醇滴加速度影响脂肪酸甲酯收率，3.43×10-4g/(g油·min)是较适宜的滴加速率。酯交换反应是可逆反应，甘油的生成不仅会影响酶的活性，而且会阻碍正反应的进行，采用多级反应，级间通过沉降分层脱除甘油，可有效提高脂肪酸甲酯收率。就Novozym 435固定化脂肪酶而言，水的加入不利于酶活性的提高，但酶促温度对其活性有很大影响，反应温度从40 ℃增加到60 ℃，脂肪酸甲酯收率相应从49.57%提高到98.75%，但考虑到过高的反应温度会影响酶的使用寿命，酶促反应的温度还需进一步研究确定。

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Production of Biodiesel through Transesterification of Soybean Oil Catalyzed by Immobilized Lipase

Chen Junyan Lu Xianghong Nie Yong Ji Jianbing

(Zhejiang Province Key Laboratory of Biofuel, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014)

Novozym 435 immobilized lipase was used as catalyst, biodiesel was prepared from Soybean oil by dripfeeding of methanol. The influences of the dropping speed of methanol, water content, reaction temperature and reaction stages on the yield of biodiesel were examined. The results showed that dripfeeding of methanol could prevent enzyme from the poisoning of methanol, and the yield of biodiesel could get to the same level as adding tert-amyl alcohol. The dropping speed of methanol and the reaction temperature had significant influences on the FAME yield, so the dropping speed of methanol and the reaction temperature could be adjusted to improve the FMAE yield. The highest biodiesel yield of 98.75% was obtained when the dropping speed of methanol was 3.43×10-4g (g methanol/g oil·min), and temperature was 60 ℃. Glycerol, the byproducts from the production of biodiesel, would influence the activity of the enzyme and the biodiesel yield. Using the secondary reaction and removing of glycerol could be helpful to improve the biodiesel yield. For Novozym 435 immobilized lipase, addition of water was against the increase of biodiesel yield.

drip-feeding,Novozym 435,transesterification,biodiesel

TQ645

A

1003-0174(2016)12-0057-05

863计划(2014AA022103)

2015-06-11

陈俊燕，女，1990年出生，硕士，生物质能源

陆向红，女，1971年出生，副教授，生物质能源