大米活性肽对H2O2诱导HUVEC氧化损伤的保护作用研究

梁 盈 王 荣 田明慧 黄 萍 蒋 鹏 吴 伟 林亲录

(稻谷及副产物深加工国家工程实验室；中南林业科技大学，长沙 410004)

大米活性肽对H2O2诱导HUVEC氧化损伤的保护作用研究

梁 盈 王 荣 田明慧 黄 萍 蒋 鹏 吴 伟 林亲录

(稻谷及副产物深加工国家工程实验室；中南林业科技大学，长沙 410004)

观察和分析了RBP处理前后对氧化损伤的HUVEC细胞生长、凋亡及超微结构的影响。MTT检测结果显示：RBP保护组与正常对照组生长状况相似、生长趋势相同、增殖能力相当。HE染色结果显示：RBP保护组细胞形态与正常对照组细胞形态相似，整体完整性较好，细胞形态及分布规则，细胞数较多，与损伤组比较保护作用明显；细胞凋亡流式检测结果显示：损伤组凋亡率为93.7%，RBP保护组的细胞存活率占72.6%，比H2O2损伤组细胞存活率高出66.6%，保护作用明显；扫描电镜结果显示：RBP保护组细胞损伤程度降低，完整性较好，胞间连接紧密，说明RBP对氧化损伤的HUVEC细胞有很好的保护作用。RBP在体外对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤有一定的保护作用。

大米活性肽 过氧化氢 人脐静脉血管内皮细胞 保护作用

大米是世界上主要粮食作物之一，全球生产量极大，全世界一半以上、我国三分之二以上的人口以大米为主食。因此，大米蛋白是人类膳食中重要的蛋白源之一[1]。大米加工过程的副产物米渣,其蛋白质的质量分数在40%以上，其组成与大米蛋白相似[2]，国外非常重视大米及其加工过程中产生的副产物的开发利用，并生产出了附加值很高的营养保健食品和化妆品[3-4]。近年来，国内也将此作为研究热点，其进展较快，已有多种来源于大米蛋白的具有不同功能的大米活性肽(Rice Bioactive Peptide，RBP)[2-3]得到确认，其中经水解制备RBP的方法有少量报道[4-8]，但仅在工艺方面有一定的研究，而对活性肽在分子、细胞、蛋白水平等方面的研究却鲜有报道。本课题组近年来一直致力于研究RBP的抗氧化作用及对人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)增殖的影响[6,9-11]。H2O2是体内常见的正常代谢生成的活性氧，一定浓度的H2O2可以导致心肌细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞和T细胞的氧化应激反应[12-13]，进而使得HUVEC细胞受损。受损的内皮细胞是多种心血管疾病的共同病理生理学基础，也是动脉粥样硬化触发的早期重要事件[14-15]，因此保护内皮细胞功能，抑制内皮细胞凋亡是防治心血管疾病研究重点之一。本试验在之前本课题组已筛选出的H2O2诱导HUVEC氧化损伤模型的最佳处理浓度、时间及RBP的最佳保护浓度、时间的基础上[11]，重复试验得到相似生长曲线后，通过对细胞形态、凋亡及细胞表面超微结构的观察测定，进一步在细胞功能水平上验证了RBP对HUVEC的抗氧化作用，为将大米活性肽开发成抗氧化性功能因子或保健因子添加剂及多肽类药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人脐静脉血管内皮细胞:湖南省长沙赢润生物技术有限公司。

1.2 大米活性肽

课题组前期从米渣蛋白中分离鉴定出部分抗氧化活性肽[5，9]，鉴定出一条氨基酸序列Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe，考虑到细胞体外培养对试验过程中体系和操作的特殊条件[16]，选用上海强耀公司生产的多肽作为试验样品(Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe)，其氨基酸组成、排列顺序等与本课题组分离出的米渣抗氧化活性肽基本一致。

1.3 试剂与仪器

二甲基亚砜(DMSO)、四氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、抗坏血酸(VC)：Sigma公司；RPMI-1640培养基：Gibco公司；叔丁醇、戊二醛、H2O2、无水乙醇、Na2HPO4、KH2PO4、二甲苯：国药集团化学试剂；胎牛血清：四季青生物工程有限公司；青、链霉素双抗：中诺药业有限公司；CO2培养箱：上海博讯医药设备厂；XDS-10型倒置显微镜：上海团结仪器制造有限公司；YDS-30B-125液氮罐：成都市金凤液氮容器有限公司；HD-3型酶标仪：上海沪西仪器厂；YX280B高压灭菌锅：上海三申医疗仪器有限公司；JSM-6380LV型扫描电镜：日本电子JEOL公司；FC500型流式细胞仪：贝克曼库尔特有限公司。

1.4 RBP处理前后氧化损伤HUVEC生长曲线的测定[12]

试验分组[11]：取3～5代对数生长期内且生长融合成单层的细胞[17]，随机分为6组(前期试验已确定H2O2诱导HUVEC氧化损伤模型的最佳处理浓度、时间及RBP的最佳保护浓度、时间[11])。

1.5 大米活性肽对氧化损伤HUVEC细胞HE染色观察检测

将对数生长期的细胞接种在放有盖玻片的6孔培养板中，按分组要求处理细胞。48 h后取出长有细胞的盖玻片，Bouin’s固定液中固定过夜，乙醇脱色后加入苏木素染色5～10 min，加入分化液分色5～10 s，流水冲洗，1%氨水返蓝，50%～90%梯度乙醇溶液脱水，加入伊红染色3～5 min，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜观察细胞形态变化，并进行拍照，保存[18]。

1.6 大米活性肽对氧化损伤HUVEC细胞凋亡流式检测

取对数生长期的细胞消化制成105个/mL的细胞悬液至六孔板中，按分组处理，72 h后终止培养。1 mL 预冷PBS重悬，500 r/min，4 ℃离心5 min，倾出上清液加入100 μL预冷的Annexin V Binding Buffer，重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温下避光反应15 min，加入400 μL预冷的Annexin V Binding Buffer，冰上避光放置，1 h内用流式细胞仪检测[19]。

1.7 大米活性肽对氧化损伤HUVEC细胞扫描电镜检测

将对数生长期的细胞接种在放有盖玻片的6孔培养板中，按分组要求处理细胞。48 h后取出长有细胞的盖玻片，2.5%戊二醛于4 ℃固定2 h。50%～95%梯度乙醇脱水，通风厨内用叔丁醇置换出乙醇，将样品放入临界点干燥仪内进行干燥，扫描电镜拍照保存[20-21]。

1.8 统计处理

各项试验均操作3次。数据使用SPSS 统计分析软件(17.0中文版)分析，均数±标准差表示(x±s)。多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 RBP处理前后氧化损伤HUVEC的生长曲线

正常对照组细胞长势良好，呈现“S”趋势，大米活性肽、VC对照组细胞与正常对照组生长状况相似，生长趋势相同；H2O2损伤组细胞较对照组细胞出现明显的生长抑制，48 h时抑制率达到54.4%；大米活性肽保护组、VC保护组细胞随时间推移，细胞活力较损伤组显著提高，48 h分别较损伤组存活率提高了81.9%、90.0%。说明大米活性肽表现出与VC能力相当的抗氧化保护活性，且对正常细胞生存活力没有影响，可以相同浓度进行后续试验。

图1 大米活性肽对氧化损伤 HUVEC 细胞生存活力的影响

2.2 RBP对氧化损伤HUVEC细胞HE染色观察检测

在不同处理液培养48 h后，正常对照组细胞形状规则，呈现HUVEC典型细胞形态，梭状、椭圆形，细胞边缘清晰可见且透亮，细胞铺展，胞内细胞器丰富，分布均匀，整体结构比较成熟，核质分区明显，表现出典型的HE染色结果，质红核蓝，有多个核仁，核仁清晰，排列有序(图2a)。RBP对照组细胞状态与正常对照组基本一致，细胞内部核仁清晰可见且质红核蓝，细胞生长状况良好(图2b)。H2O2氧化损伤组细胞膜破裂，细胞形状不规则，细胞形态发生了明显变化，呈现出损伤状态，且数目明显减少，细胞拉长皱缩，胞内细胞器模糊不清，胞内物质外溢，呈极性状；核蓝可观察到，但核质辨别不清；胞内的各种细胞器数量明显减少，形状改变，排列不规则，细胞核变小，核仁不清晰且数目减少；细胞质皱缩、拉长，HE染色较深(图2c)。RBP保护组细胞形态与正常对照组细胞形态相似，整体完整性较好，细胞较成熟，虽然也有损伤但细胞膜完整，可看到核蓝质红，细胞器分布及形态规则，细胞数目较多，与损伤组比较保护作用明显(图2d)。

图2 不同处理组细胞形态结构 (×200)

2.3 RBP对氧化损伤HUVEC细胞凋亡流式检测

Annexin V检测细胞凋亡的原理是，将Annexin V 经过绿色荧光FITC探针标记，正常细胞内与Annexin V反应的磷脂酰丝氨酸只分布于细胞膜的磷脂双分子层内部，因此，如果是长势良好的正常细胞是不会被FITC所标记的，即通过流式细胞仪检测正常细胞处于左下象限，而当细胞受到损伤，细胞发生破裂时，细胞质膜内的磷脂酰丝氨酸向外翻出，立即与荧光染料结合，因此早期凋亡细胞分布在右下象限。PI是一种核酸染料，它不能穿过完整的细胞膜，但是可以通过坏死或者晚期凋亡的细胞膜而对细胞核进行染色，因此晚期凋亡到坏死细胞分布在左上象限。RBP对氧化损伤HUVEC细胞凋亡流式检测结果显示，在正常对照组和RBP对照组中细胞存活率较高，分别达到90.1 %、90%(图3a、3b)；而H2O2损伤组细胞存活率很低，仅有6.0 %，而晚凋坏死细胞占93.7%(图3c)，坏死率较高一部分是由于H2O2处理时间过长引起的，但绝大部分是由于H2O2对HUVEC产生了氧化损伤导致的；RBP保护组的细胞存活率占72.6%，比H2O2损伤组细胞存活率高出66.6 %，且晚期细胞凋亡数量明显减少，仅占27.3 %，可以看出RBP保护作用明显(图3d)。

图3 大米活性肽对氧化损伤HUVEC凋亡的检测

2.4 大米活性肽对氧化损伤HUVEC细胞扫描电镜检测

扫描电镜结果显示，在300倍的视野范围内，正常对照组与大米活性肽对照组细胞数量大致相同，数目较多，氧化损伤组数目明显减少，大米活性肽保护组细胞数量介于这两者之间。在2 000倍视野中的扫面图片如图4显示，细胞处于正常生长状态时，细胞平铺，细胞连丝丰富，细胞生长旺盛(图4a)；氧化损伤组细胞整个细胞处于破裂状态，细胞有凋亡小体流出，细胞间连接松散，胞间间隙较大，细胞解体，处于明显损伤状态(图4c)；大米活性肽对照组与正常对照组结果相似，细胞生长良好，胞间连接紧致，细胞生长状况良好(图4b)；大米活性肽保护组虽然细胞有损伤但是完整性较好，细胞间连接也较紧密(图4d)，扫描电镜观察的结果直观，说明了大米活性肽对氧化损伤的HUVEC细胞有很好的保护作用。

图4 RBP对氧化损伤HUVEC细胞扫描电镜检测

3 讨论

由于血管内皮细胞损伤在多种心血管疾病发生和发展过程中起着关键作用，对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用成为近年来研究的热点。杨丽娟[22]通过加入叔丁基氢过氧化物诱导HUVEC氧化损伤，损伤组的OD值为0.57±0.060，而加入50 mg/L的灵芝多糖肽保护组可减轻叔丁基氢过氧化物对HUVEC的氧化损伤，OD值达0.91±0.057；董靖[23]研究了护骨素对软脂酸诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用，发现与正常对照组相比，软脂酸组HUVEC细胞活性明显被抑制，流式细胞仪检测显示软脂酸组HUVEC细胞凋亡率显著增加，而加入护骨素后，其凋亡率明显降低。本试验重点研究了RBP在细胞水平的保护作用，从HE染色形态上观察，可看出RBP保护组细胞保护作用明显；从细胞凋亡流式检测结果显示：损伤组凋亡率为93.7%，RBP保护组的细胞存活率占72.6%，比H2O2损伤组细胞存活率高出66.6%，且晚期细胞凋亡数量明显减少，仅占27.3%，保护作用明显；扫描电镜结果显示：RBP保护组细胞损伤程度降低，完整性较好，胞间连接紧密，说明RBP对氧化损伤的HUVEC细胞有很好的保护作用。对于后续的体外蛋白水平(细胞全蛋白及核、质蛋白的提取及western blot分析)和分子水平(通过PCR扩增仪进行mRNA的损伤分析)的研究；以及对于体内过氧化损伤(建立动物样本模型)的保护作用和机体免疫功能的研究也在进展中。通过更深入的对大米活性肽的功能和性质的研究工作，必将会为后续的开发利用，从而生产出有益功能性质的食品保健品、食品添加剂和多肽类药物等产品做出成绩。

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The Protective Effects Research of RBP on Oxidative Damage in HUVEC Induced by H2O2

Liang Ying Wang Rong Tian Minghui Huang Ping Jiang Peng Wu Wei Lin Qinlu

(National Engineering Laboratory For Rice and By-Product Deep Processing;Center South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)

This experiment observed and analyzed the influence of RBP on HUVEC cells growth which was damaged by H2O2growth, cycle and surface ultrastructure. The results of MTT test show the RBP protection group was similar to the normal control group in growth conditions, and growth tendency and multiplication capacity were the same. The results of HE staining showed that cellular morphology of the RBP protection group was similar, the overall integrity was good, cellular morphology and distribution were regular, and the number of cells was more compared with the he normal control group; the protection effects were obvious compared with the damage group. The results of flow cell apoptosis detection showed that the damage rate of oxidative damage group cells was 93.7%,however,the protection rate of RBP protection group cells was 72.6%.The results of scanning electron microscopy showed that RBP protection group was in a good integrity and integrity connections between cells were relatively close, and in a low damage rate. The results could directly showed that RBP on oxidative damage of HUVEC cells had good protection effects. The conclusion showsed that RBP could protect the HUVEC cells induced by oxidative damage of H2O2.

rice bioactive peptide, hydrogen peroxide, human umbilical vein endothelial cell, protective effect

TS201

A

1003-0174(2016)12-0001-06

国家自然科学基金(31201348/31571874)，湖南省自然科学基金(13JJ4086)，长沙市科技计划(K140 3039-21)，湖南省教育厅科学研究项目(12C0439)

2015-05-14

梁盈，女，1981年出生，副教授，分子营养学

林亲录，男，1966年出生，教授，稻谷深加工