miR-497与肾癌预后的关系及其对肾癌786-0细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

张旖骁， 吴 斌

(中国医科大学附属盛京医院第一泌尿外科，辽宁 沈阳 110004)



miR-497与肾癌预后的关系及其对肾癌786-0细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

张旖骁， 吴 斌△

(中国医科大学附属盛京医院第一泌尿外科，辽宁 沈阳 110004)

目的： 探讨微小RNA-497(miR-497)与肾癌预后的关系及其对肾癌786-0细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:收集2011年～2015年80例肾细胞癌患者手术切除的癌组织和癌旁组织并回顾性分析患者随访资料。采用实时定量PCR 法检测癌组织及配对的癌旁组织中miR-497的表达。在肾癌细胞系786-0中转染miR-497模拟物，应用MTT法、台盼兰拒染法活细胞计数、流式细胞术和Transwell小室实验检测miR-497对786-0细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。通过生物信息学预测miR-497在786-0细胞中作用的靶基因。Western blotting法检测miR-497对靶基因蛋白表达影响。结果:肾癌组织中miR-497的表达量明显低于癌旁组织(P<0.05)。786-0中miR-497表达量明显低于正常肾上皮细胞中miR-497表达量(P<0.05)。随访时间2～48个月，中位随访时间29个月，失访6例，随访率92.5%。76例患者3年无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)为55.2%。高miR-497表达组和低miR-497表达组肾癌患者的RFS分别为71.2% 和40.1%，差异有统计学显著性(P<0.05)。过表达miR-497可显著抑制786-0细胞的增殖和侵袭能力，显著促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达miR-497可显著抑制786-0细胞中cyclin D1蛋白的表达(P<0.05)。结论:miR-497与肾癌预后相关，miR-497能明显抑制肾癌786-0细胞的增殖和凋亡，其机制可能与其靶向抑制cyclin D1有关。

肾细胞癌； 微小RNA-497； 细胞增殖； 预后

微小RNA(microRNA,miRNA)是存在于动植物中的一类高度保守的非编码小分子RNA[1-2]。它们可以特异性地与靶基因mRNA的3’非翻译区发生互补结合，影响蛋白的翻译过程或降解靶基因mRNA，以此对靶基因产生抑制作用[3-4]。最新研究表明，miR-497表达下调与多种肿瘤预后相关[5]，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具。我们检测肾癌组织和细胞系786-0中miR-497的表达水平，同时分析其与肾癌患者预后的关系，以针对miR-497的模拟物转染肾癌细胞系786-0，观察其对786-0细胞增殖、凋亡和侵袭的影响并探讨其可能机制。

材 料 和 方 法

1 病例收集与实验材料

选择我院2011年至2015年手术切除的原发性肾细胞癌标本80例，病理检查证实为透明细胞癌41例, 乳头状癌39例。其中男58例，女22例, 年龄46～75岁，平均49.7岁。采用美国肿瘤联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)标准作临床分期：IV期21例、III期25例、II期22例、I期12例。按照世界卫生组织标准进行组织学分级：低分化20例、中分化22例、高分化38例。另取癌旁正常肾脏组织(距离癌灶组织边2～5 cm)作为对照。患者术前均未进行化疗和放疗，所有样本采集均符合医学伦理学规定，患者均签署知情同意书。随访时间2～48个月，中位随访时间29个月，失访6例，随访率92.5%。

人肾小管上皮细胞系HK-2及人肾细胞癌细胞系786-0购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；RPMI-1640培养液购自Gibco；胎牛血清购自HyClone；TRIzol购自Invitrogen；miRNA分析系统购自Applied Biosystems；PrimeScript RT-PCR反转录试剂盒和SYBR Premix Ex-Taq 荧光定量PCR试剂盒均购自TOYOBO；miR-497模拟物及阴性对照miRNA购自上海吉玛公司；细胞增殖检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗人单抗cyclin D1购自Abcam；细胞裂解液CLB购自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 实时荧光定量PCR检测人肾癌组织、癌旁组织以及786-0和HK-2中miR-497的表达 采用TRIzol试剂提取相应的人组织和细胞中总RNA。采用SYBR Premix ExTaq 荧光定量PCR试剂盒和LightCycler仪器进行操作和分析。miR-497的逆转录引物序列：miR-497 模似物的上游引物为5’- CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3’，下游引物为5’-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3’；内参照U6的上游引物为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，下游引物为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。反应条件为94 ℃ 15 s；94 ℃ 20 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，40次循环；72 ℃ 10 min。肾癌组织和细胞中miR-497的表达量采用2-ΔΔCt计算。

2.2 细胞培养和miR-497模拟物的转染 人肾癌细胞系786-0和肾小管上皮细胞系HK-2分别用含10%胎牛血清的RPMI-1640和DMEM/F12培养液培养，均置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中传代培养。将处于对数生长期的786-0细胞接种于6孔培养板，每孔细胞数约为2×105个，当细胞生长融合度至50%时，将其分为miR-497模拟物转染(miR-497)组和阴性对照(control)组，培养液中加入INTERFERin以提高转染效率。转染时每孔miR-497模拟物或者对照miRNA的终浓度均为20 nmol /L，INTERFERin为4 μL，转染48 h或72 h。实验重复3次。2.3 MTT法检测miR-497对786-0细胞活力的影响 786-0细胞转染miR-497模拟物或者阴性对照miRNA 72 h 后，将转染组和对照组细胞按照每孔细胞数量2×104个接种于96 孔培养板中，并各设置3个平行孔，3～4 h后，待细胞贴壁后加入100 μL 1640完全培养液继续培养，1 d、2 d、3 d和4 d后分别每孔加入MTT 10 μL (5 g/L)，置37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜100 μL,酶标仪570 nm波长下测定吸光度(A)值。实验重复3次。

2.4 台盼兰拒染法活细胞计数检测miR-497对786-0细胞增殖的影响 786-0细胞转染miR-497模拟物或者阴性对照miRNA 72 h 后，将转染组和对照组细胞按照每孔细胞数量1×105个接种于6 孔培养板中，并各设置3个平行孔，3～4 h后，待细胞贴壁后加入100 μL RPMI-1640完全培养液继续培养，1 d、2 d、3 d和4 d后胰酶消化各孔细胞并用台盼兰染色计数。实验重复3次。

2.5 流式细胞术检测miR-497对786-0细胞凋亡的影响 收集上述各组细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，2 000 r/min离心5 min收集细胞。在50 μL的binding buffer中加入5 μL Annexin Ⅴ染液，混匀；加入5 μL 7-AAD染液至收集细胞中，室温，避光反应5～15 min；样品在30 min内应用流式细胞仪检测。实验结果应用FlowJo软件分析细胞凋亡情况。实验重复3 次。

2.6 Transwell小室实验检测miR-497对786-0细胞侵袭能力的影响 消化转染后的细胞离心后用含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM培养基重悬，按照5×105个细胞接种于Transwell上室中(上室铺60 μL稀释后的Matrigel)。在下室中，每孔加人500 μL 含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基, 并放置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，对小室下边细胞应用苏木素染核，显微镜下拍照和计数。

2.7 生物信息学预测 利用生物信息学网站TargetScan (http://www.targetscan．org)进行生物信息学预测，分析结果显示miR-497可能的靶分子为cyclin D1。

2.8 Western blotting法检测miR-497对786-0细胞cyclin D1蛋白表达的影响 786-0细胞转染72 h后，收集转染组和对照组细胞，用细胞裂解液裂解细胞。BCA法测定蛋白浓度，取50 μg 蛋白经8% SDS-PAGE 分离后，转至PVDF 膜，室温封闭1 h，分别加入抗cyclin D1抗体(1∶500)、抗GAPDH抗体(1∶10 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加过氧化物酶标记的 II 抗，室温孵育1 h，洗膜，最后用ECL法显影。GeneGnome采集图片并利用ImageJ软件进行灰度值分析。实验重复3 次。

3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件处理数据，随访数据采用Kaplan-Meier法，并绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank检验。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用配对或者不配对的t检验分析数据，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-497在肾癌细胞系786-0及肾癌组织中的表达

实时荧光定量PCR 法检测肾癌细胞系786-0和人肾小管上皮细胞系HK-2的相对表达量，结果显示以HK-2为对照，786-0细胞的miR-497表达明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)。实时定量PCR 法检测80例肾癌患者的癌组织与癌旁组织中miR-497的相对表达量，结果显示癌组织中的miR-497表达明显低于配对的癌旁组织，差异有统计学显著性(P<0.05),见图1。

Figure 1. Low expression of miR-497 in human renal cancer tissues and cell line. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHK-2;#P<0.05vsadjacent tissues.

图1 miR-497在肾癌细胞系及肾癌组织中低表达

2 肾癌组织miR-497的表达与预后的相关性

对80例肾癌患者进行Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示术后3年无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)为55.2%，高表达miR-497组患者的3年RFS为71.2%，低表达miR-497组患者的3年RFS为40.1%，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图2。

3 过表达miR-497对786-0细胞增殖的影响

实时荧光定量PCR检测转染后miR-497在转染组细胞和对照或空白组细胞表达量差异，结果显示转染组细胞的miR-497表达量是对照或空白组的15倍左右，差异有统计学显著性(P<0.01)。利用MTT法检测转染组和对照组的细胞活力，过表达miR-497抑制786-0细胞活力。台盼兰拒染法活细胞计数检测miR-497对786-0细胞增殖的影响，与对照相比，过表达miR-497抑制786-0细胞的生长，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

4 过表达miR-497对786-0细胞凋亡的影响

应用流式细胞术对转染组和对照组细胞的凋亡进行检测。结果显示，与对照相比，过表达miR-497的786-0细胞的凋亡比例明显增加，差异有统计学显著性 (P<0.05)，见图4。

Figure 2.Low expression levels of miR-497 were associated with a poor recurrence-free survival rate compared with high expression levels of miR-497.

图2 低表达miR-497肾癌患者无复发生存率较低

Figure 3. miR-497 inhibited the growth of 786-0 cells. A: 786-0 cells were transfected with miR-497 mimics or negative control miRNA, and then miR-497 expression levels were analyzed by RT-qPCR; B: over-expression of miR-497 induced low viability of the indicated cells detected by MTT assay; C: over-expression of miR-497 inhibited 786-0 cell proliferation at 3 d and 4 d detected by the method of Trypan blue exclusion. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图3 过表达miR-497对786-0细胞增殖的影响

Figure 4.Over-expression of miR-497 affected apoptosis of 786-0 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4 过表达miR-497对786-0细胞凋亡的影响

5 过表达miR-497对786-0细胞侵袭能力的影响

应用体外Transwell小室实验检测转染组和对照组细胞的侵袭能力。结果显示与对照相比，过表达miR-497的786-0细胞的侵袭能力受到显著抑制，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图5。

6 过表达miR-497抑制cyclin D1蛋白的表达

应用Western blotting法检测miR-497对786-0细胞cyclin D1蛋白表达的影响。结果显示与对照组相比，过表达miR-497降低了786-0细胞中cyclin D1蛋白的表达水平，见图6。

Figure 5.Transwell invasion assay of 786-0 cells after over-expression of miR-497. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图5 过表达miR-497对786-0细胞侵袭能力的影响

讨 论

miRNA能与多种靶基因结合，具有可预测性的特点。越来越多的文献表明，miRNA可以作为一项工具来调控与肿瘤发生发展有关的信号通道和一些关键基因或因子，并将与肿瘤有关的这一类miRNA称为oncomir[4-5]。目前，与肾癌相关的miRNA研究已取得了一些进展，但目前明确对肾癌发生发展具有调控作用的miRNA仍需继续发掘。

Figure 6. The protein levels of cyclin D1 were inversely related with miR-497 levels in the 786-0 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图6 过表达miR-497对786-0细胞cyclin D1蛋白表达的影响

miR-497作为miRNA家族中的一员，参与了多种肿瘤的发生发展。在胃癌、胰腺癌和乳腺癌中发现miR-497表达下调，并且同肿瘤细胞增殖呈负相关[6-7]。Zhao等[5]通过芯片分析发现miR-497与肾癌预后相关。本研究发现，miR-497在肾癌细胞系786-0中表达明显降低，提示miR-497的表达水平与肾癌的发生有显著相关性。同时我们分析了肾癌癌组织和癌旁组织中miR-497的相对表达，发现肾癌癌组织中miR-497表达明显下调。通过对80例肾癌患者进行随访，随访结果显示，高表达miR-497组患者3年RFS为71.2%，低表达miR-497组患者3年RFS为40.1%，差异有统计学显著性，此结果与之前文献报道的结果一致[5]，提示miR-497可能参与调控肾癌的发生发展。

为进一步研究 miR-497在肾癌发生发展中的作用，我们体外构建了过表达miR-497的786-0细胞。MTT实验、台盼兰拒染法活细胞计数、流式细胞术和Transwell小室实验结果表明，与对照组的比较，转染 miR-497模拟物的786-0细胞的细胞增殖和侵袭能力均明显下降，而细胞凋亡明显增加。该结果进一步提示，miR-497在肾癌发生发展中可能扮演着抑癌基因的作用。

Cyclin D包括D1、D2和D3 多个亚类，它们的基因序列及氨基酸序列的同源性较高，功能上也具有一定的重叠性，其中cyclin D1在大多数组织细胞内占主导地位，因此也相对重要[8]。该基因位于染色体11q13，长度为120 kb。Cyclin D1作为原癌基因，在调节细胞从G1期进入S期中发挥重要作用[9]。有研究显示cyclin D1在膀胱癌中呈高表达, 癌旁组织中呈低表达，差异有统计学显著性。上述结果提示cyclin D1在膀胱癌中的异常表达可能参与膀胱癌的发生、发展过程[10]。我们通过生物信息学预测cyclin D1可能是肾癌细胞系786-0中miR-497发挥作用的靶基因。Western blotting实验结果发现，miR-497能显著降低786-0细胞中cyclin D1蛋白表达，这一结果揭示miR-497可能通过靶向抑制cyclin D1从而参与调控肾癌细胞增殖和凋亡。研究表明，一个miRNA可同时影响多个基因的表达，从而调控细胞的生物学特性。由此，我们推测miRNA-497可能通过影响其它基因的表达来调控肾癌细胞侵袭能力，其具体机制还有待于深入研究。

[1] Tutar Y. miRNA and cancer; computational and experimental approaches[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2014, 15(5):429.

[2] 唐夏莉, 焦德敏, 陈 君,等. miRNA-126对肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EGFR/AKT/mTOR信号通路的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(3): 458-463.

[3] Munari E, Marchionni L, Chitre A, et al. Clear cell papillary renal cell carcinoma: micro-RNA expression profiling and comparison with clear cell renal cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma[J]. Human Pathol, 2014, 45(6):1130-1138.

[4] Bing Z, Hua Z, Donghua G, et al. MiRNA-30a-mediated autophagy inhibition sensitizes renal cell carcinoma cells to sorafenib[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 459(2):234-239.

[5] Zhao X, Zhao Z, Xu W, et al. Down-regulation of miR-497 is associated with poor prognosis in renal cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1):758-764.

[6] Li D, Zhao Y, Liu C, et al. Analysis of miR-195 and miR-497 expression, regulation and role in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(7):1722-1730.

[7] Xu J, Wang T, Zhe C, et al. MiR-497 downregulation contributes to the malignancy of pancreatic cancer and associates with a poor prognosis[J]. Oncotarget, 2014, 5(16):6983-6993.

[8] 燕海娇，蒋敬庭，刘文松，等. 慢病毒介导微小RNA-20a过表达抑制胰腺癌细胞的增殖[J]. 中华实验外科杂志，2012, 29(9):1771-1774.

[9] Hernández-Hernández OT, Camacho-Arroyo I. Regulation of gene expression by progesterone in cancer cells: effects on cyclin D1, EGFR and VEGF[J]. Mini Rev Med Chem, 2013, 13(5):635-642.

[10]Liang Z, Li S, Xu X, et al. MicroRNA-576-3p inhibits proliferation in bladder cancer cells by targeting cyclin D1[J]. Mol Cell, 2015, 38(2):130-137.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Association of miR-497 and prognosis in patients with renal cell carcinoma and its effects on proliferation, apoptosis and invasion of human renal cell carcinoma cell line 786-0

ZHANG Yi-xiao, WU Bin

(DepartmentofUrologySurgery,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China.E-mail:wub@sj-hospital.org)

AIM: To investigate the association of microRNA-497 (miR-497) and prognosis in the patients with renal cell carcinoma (RCC) and its effects on the proliferation, apoptosis and invasion of human RCC cell line 786-0. METHODS: Paired RCC and adjacent non-tumor tissue specimens were surgically collected from 80 patients who were diagnosed with primary RCC between 2011 and 2015. The expression of miR-497 in the paired RCC and adjacent non-tumor tissue specimens was detected by real-time PCR. Recurrence-free survival was estimated using the Kaplan-Meier method and compared using the log-rank test. The 786-0 cells were transfected with miR-497 mimics or scramble control miRNA. The proliferation, apoptosis and invasion abilities of the transfected cells were assessed by MTT assay, Trypan blue exclusion, flow cytometry and Transwell chamber experiment. The protein expression of miR-497-targeted gene cyclin D1 in the transfected cells was quantified by Western blotting. RESULTS: miR-497 was down-regulated in the RCC specimens compared with the adjacent tissues. miR-497 was down-regulated in the RCC 786-0 cells compared with the HK-2 cells. By the end of the study, 74 cases were followed up. The follow-up rate was 92.5%. Median follow-up was 29 months (ranging from 2 months to 48 months). The 3-year recurrence-free survival rates of the patients with high and low miR-497 expression were 71.2% and 40.1%, respectively. Over-expression of miR-497 resulted in significant suppression effect on RCC cell proliferation, invasion and the expression of cyclin D1. CONCLUSION: Low expression of miR-497 was correlated with poor prognosis in the RCC patients. miR-497 inhibits proliferation and invasion of RCC 786-0 cells and its mechanism is associated with the down-regulation of cyclin D1.

Renal cell carcinoma; MicroRNA-497; Cell proliferation; Prognosis

1000- 4718(2016)11- 1979- 05

2016- 05- 10

2016- 09- 09

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.010

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 96615-34111; E-mail： wub@sj-hospital.org